왜 컬럼 세척할 때 naoh를 사용하는가

Chromatography 관련 자주 묻는 질문과 그에 대한 답을 확인해보세요.

• [NEW] Evaluation 창에서 lock이 걸린 results 파일들은 수정이 안되는데, lock 해제하는 방법을 알고 싶습니다. 그리고 잠금이 되는 이유는 무엇일까요?

  이런 경우에는 Administration 창에서 Database Management - Release Objects – 해당 데이터 선택 – Release 클릭하시면 lock을 해제하실 수 있습니다.

  여러 명의 사용자가/여러 개의 unicorn 소프트웨어에서 동일한 결과를 보거나 편집할 때 results에 lock 이 걸릴 수 있습니다.

  또는 PC를 강제 종료하거나, 정전 또는 데이터베이스 연결 실패하는 경우와 같이 Unicorn에 갑작스러운 영향을 주는 액션이 가해진 경우

  정상적으로 로그아웃/종료되기 전에 열려 있던 결과가 데이터베이스에 잠긴 상태로 유지될 수 있습니다.

• [NEW] Unicorn 내method 또는 result 파일은 어느 폴더 경로에 저장되나요? C드라이브에 저장되나요?

  Unicorn 6.x 이상의 버전에서는 method 와 result 파일이 특정 폴더에 저장되는 방식이 아닌, 데이터베이스에 저장됩니다.

  만약, method 나 result 파일을 따로 저장하길 원하신다면, Method Editor, Evaluation 창에서 각각 Export 한 후 저장하시면 됩니다.

  • Method file Export 방법:

  Method Editor 창에서 Export 할 Method 파일을 여신 후에 File - Export – To Unicorn – Method(s) 를 클릭하시면 Zip 포맷으로 저장됩니다.

  Zip포맷의 Method 파일은 다른 Unicorn 소프트웨어에서 열 수 있습니다.

  • Result file Export 방법:

  Evaluation 창에서 Export 할 Result 파일을 여신 후에 File - Export – To Unicorn – Entire Result(s) 를 클릭하시면 Zip 포맷으로 저장됩니다.

  Zip포맷의 Result 파일은 다른 Unicorn 소프트웨어에서 열 수 있습니다.

  추가적으로 Export – Externally를 클릭하시면 4가지 옵션(Curves, Peak Table, Documentation, Copy to Metafile)을 보실 수 있습니다.

  ‘Copy to Metafile’ 은 Chromatogram을 그림만 포맷으로 export 할 수 있으며, ‘Peak Table’ 은 Peak table 데이터를 엑셀 포맷으로 export 할 수 있습니다.

  ‘Documentation’ 은 Run log, System information, Result information, Method information 등 원하는 정보만을 선택하여 export 할 수 있습니다.

• 컬럼 팩킹 후 컬럼 효율 평가를 위해 추천하는 유속과 샘플 볼륨이 있을까요?

  컬럼 효율성 평가는 사용하고자 하는 용매에 1~2% Acetone 또는 NaCl 을 샘플로 주입하여 흡광도 혹은 전도도의 peak 을 통해 평가합니다.
  샘플과 사용할 완충액은 레진 종류에 따라 선택하시면 됩니다. 아래 테이블 참고하시기 바랍니다.

  

  컬럼 효율성 평가에서 유속은 Peak broadening 에 큰 영향을 미칩니다.
  입자 크기는 최적의 유속을 설정하기 위해 중요한 요소 이므로, 아래 표를 참고하여 유속을 설정하시기 바랍니다.

  

  샘플 볼륨은 일반적으로 컬럼 볼륨(Column volume) 의 1% 를 권장 드립니다. 다만, 사용하는 장비나 물질에 따라 편차가 있을 수 있습니다.

• HisTrap 컬럼이 갈색으로 변했습니다. 컬럼을 사용해도 괜찮을까요?

  컬럼이 갈색으로 변한 이유는 레진 내에 느슨하게 결합되어 있던 Ni 2+ 이온이 환원제가 만나 환원되면서 변합니다.
  정제를 하기 전에, 환원제가 없는 완충액을 사용하여 Blank run 을 돌려서 컬럼 내 남아있던 Ni2+ 이온을 씻어주는 것을 권장 드립니다. 만약 이미 변색되었다면, 아래와 같은 방법을 통해 washing 할 수 있습니다.

  1. 20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 50 mM EDTA, pH 7.4 (Stripping buffer) 를 최소 3CV 만큼 흘려 세척합니다.
  2. 유속을 멈춘 상태에서 over night 동안 Incubation 합니다.
  3. Binding buffer -> DW 순서로 세척합니다.
  4. (옵션사항) 추가적인 세척을 원한다면, 1 M NaOH -> Binding buffer -> DW 순서로 세척합니다.
  5. 0.1 M NiSO4 in distilled water (Recharging buffer) 을 컬럼의 매뉴얼에서 권장하는 양만큼 흘려줍니다.
  6. 5 CV 의 DW -> 5 CV 의 binding buffer (to adjust pH) 순서로 세척 후 20% EtOH 을 흘려 보관합니다.

• 컬럼을 구매하려고 합니다. 컬럼 이름 뒤에 GL, PE 이라고 적혀 있는데, 그 의미가 궁금합니다.

  Pre-packed column 의 경우 컬럼 이름이 5/50 GL, 10/100 GL, 4.6/100 PE 등으로 명시된 것을 보실 수 있습니다.
  앞 숫자는 컬럼의 직경(mm), / 뒤의 숫자는 컬럼 높이(mm) 라고 생각하시면 됩니다. GL, PE는 컬럼의 재질로, 각각 Glass 와 PEEK 을 의미합니다. 직경이 4.6 mm 인 경우 PEEK 재질로 만들어져 높은 압력에도 견딜 수 있습니다.

• 단백질 정제 시 purity와 resolution 문제는 어떻게 해결하나요?

  링크된 페이지를 통해, 단백질 정제 시 purity, resolution issue 해결 방법을 확인해보세요.

• MabSelect VL 레진은 어떤 제품인가요?

  Fab나 이중 항체(Bispecific Ab) 등 Kappa light chain을 내재하고 있는 변형 항체를 정제할 때 사용할 수 있는 Protein L 친화 크로마토그래피 레진으로 항체 종류의 다양성이 높아지면서, 이러한 변형 항체들에 대한 정제 수요가 커지고 있습니다. MabSelect VL은 Protein A 레진의 대체제로서 Fabs, 이중 항체 등 kappa light chain을 내재하고 있는 다양한 변형 항체들의 Capture 단계에서 유용하게 사용될 수 있습니다.
  높은 DBC(Dynamic binding capacity)를 통해 정제하고자 하는 물질을 효율적으로 정제할 수 있으며, 0.1M NaOH 세척 환경에서도 안정적이기 때문에 바이오 버든으로 인한 오염 위험을 줄일 수 있습니다. 이중 항체 정제의 첫 번째 capture단계에서 타겟 관련 불순물들에 대한 높은 해상도를 제공합니다.

• ÄKTA start를 사용하여 viral 단백질을 정제할 수 있을까요?

  링크된 페이지를 통해, ÄKTA start를 사용한 viral 단백질 정제 방법을 확인해보세요.

• Downstream에서의 Mechanistic modeling은 무엇인가요?

  Accelerate downstream process development with mechanistic modeling 영상을 통해 확인해보세요.

  또한 싸이티바 웨비나 허브에서 2022년 5월 진행된 스마트한 정제 공정 개발을 위한 새로운 전략적 접근 웨비나를 시청하여 Mechanistic modeling을 자세히 알아보실 수 있습니다.

• 유사도 측정을 이용하여 단백질 공정의 최적화하는 방법은 어떤 것이 있나요?

  링크된 페이지를 참조하여 최적화하는 방법을 확인해보세요.

HPLC의 응용은 무궁무진하여 제약, 식품, 바이오, 환경, 전자 등 여러가지 분야에 다양한 방법으로 시행되고 있습니다. HPLC에서 가장 많이 사용되는 충진제는 아무래도 역상계 그 중에서도 C18계열의 컬럼이 아닐까 생각됩니다. C18계열 컬럼은 회사별로 또는 같은 C18컬럼에서도 종류별로 분리능과 분리거동이 천차만별로 나타납니다. 아마도 그 종류만큼이나 다양한 종류의 샘플이 있기 때문으로 생각되는데요. HPLC컬럼에서 중요하게 생각되는 특징이 분리 특성이나 재현성도 있지만 얼마만큼 오래 사용이 가능한 지도 유저 입장에서는 무시할 수 없는 특징이지요. 

 HPLC 컬럼은  실험실에서 흔히 사용하는 소모품보다는 상당한 고가이기 때문에 사용 후에는 세척이나 보관에 특별히 신경을 쓸 수 밖에는 없습니다. 문제는 세척에 무척 신경이 썼음에도 컬럼의 오염으로 사용이 힘든 경우도 발생할 수 있습니다.

 보통 역상계 HPLC컬럼에서 많이 사용하는 샘플은 비극성도가 높은 유기물 계열입니다. 따라서 이동상에서 유기용매의 함량을 늘려주면 세척이 되는 경우가 많습니다. 당 종류 같은 극성도가 높고 점도가 있는 샘플은 수분함량을 늘리고 온도를 높여주지요. 이동상에 산을 미량 첨가하여 pH를 낮춰 주면 세척이 잘 되는 경우도 있습니다. 이상의 세척방법은 보통 역상계에서 많이 사용하는 방법이고, 흔히 잘 알려진 방법입니다. 보통 HPLC컬럼의 특성상 고압을 견뎌야 하기 때문에 실리카 베이스를 사용하여 pH 2~7정도의 영역에서는 문제없이 사용가능한 경우가 대부분입니다.

 그렇다면 알칼리세정액은 HPLC 컬럼에서는 사용할 수 없는 것일까요? 상당 부분 맞는 얘기입니다. pH가 높은 영역에서는 베이스가 되는 실리카가 녹기 때문에 높은 pH의 세정은 컬럼을 망가뜨릴 수 있는 안 좋은 방법입니다. 그렇다면 높은 pH의 세정이 아예 불가능한 것일ㄲ요? 최근에는 단백질이나 펩타이드 같은 물질의 분석이나 분취 시에 역상 컬럼을 사용하는 경우가 많이 늘어났습니다. 단백질의 세정은 아무래도 높은 pH의 용리액이 적당할 것입니다.

 컬럼을 만드는 여러 회사에서는 높은 pH에서 사용이 가능한 컬럼들을 많이 출시하였습니다. 실리카 베이스의 제조시 고분자와 hybrid하여 떨어지지 않도록 하는 거죠.

 YMC의 Triart는 유기실리카와 무기실리카의 triple layer를 구성하여 고압에 견딜 수 있는 특징과 오랜 시간 사용할 수 있는 내구성을 갖춘 컬럼입니다. 하지만 무엇보다 큰 장점은 높은 pH에서도 쉽게 열화되지 않는다는 점입니다.

 YMC의 Triart 계열의 컬럼을 소지하신 분들에게 소개해드리는 컬럼의 알칼리 세정법입니다.

인슐린과 인간 혈장 시료를 주입하여 분석하는 방법입니다. 오른쪽과 같은 조건에서 분석을 실시하고 왼쪽과 같은 방법으로 세정을 실시합니다. 총 20번 주입하고 알칼리 세정을 통해 컬럼을 세척하여 재생하는 과정을 다이아그램으로 나타내었습니다.

 위와 같은 세정방법으로 컬럼을 재생한 결과 아래 그림과 같이 컬럼이 재생된 것을 보실 수 있습니다. 시료 주입 초기에는 깨끗한 peak를 볼 수 있지만 20회 정도 주입하면 앞쪽에 고스트 peak도 나타나고 retention time도 틀어진 것을 확인할 수 있습니다. 알칼리 세정을 할 수 없다면 20회 정도 분석 후에는 컬럼을 사용하지 못하는 결과를 가져오게 됩니다. 하지만 알칼리 세정 후에 아래 그림처럼 초기와 거의 동일한 peak를 재현하는 것을 확인할 수 있습니다.

그렇다면 Triart는 몇번이나 세정이 가능할까요? 현재 분석치로는 70회 이상 진행하여도 분리능에 전혀 문제가 없는 것으로 나타났습니다. 아래 그림을 보면 Triart는 70회 세정 후에도 주입초기와 동일한 분리능을 보이는 반면 기존 실리카겔 베이스 충전제는 세정 후에 성능이 떨어지는 것을 확인할 수 있습니다. Triart는 기존 컬럼에 비해 내구성이 2배 이상인 것을 확인할 수 있습니다.

YMC

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