어느 도시에서는 혈액형 o를 가진사람의 비율이 0.4다

[발명의 명칭]

글리코시드 결합의 액상 및 고상 형성

[도면의 간단한 설명]

제1도는 성분 모노사카라이드로부터 일단계로 시클라마이신 0의 보호 트리사카라이드를 합성하는 방법을 도시한 도면.

제2도는 일단계로 2-데옥시 푸코스의 호모폴리머를 형성하는 방법을 도시한 도면.

제3도는 DNA 결합 활성을 비롯하여, 생물학적 활성을 가진 글리코콘주게이트의 혼합물을 합성하는 방법을 도시한 도면, 이와 같이 제조된 글리코콘주게이트를 이어서 스크린닝하여(예, DNA 결합 활성에 대해) 시험된 활성을 기초로 글리코콘주게이트의 올리고사카라이드 부분의 바람직한 길이 및 바람직한 슈가 잔기를 평가할 수 있다.

제4도는 고체 지지체(예, 폴리스티렌 수지)로부터 결합의 두가지 실예 형태를 형성하고 제거하는 방법을 도시한 도면.

제5도는 고상 올리고사카라이드 합성을 수행하는데 사용된 장치를 도시한 도면.

제6도는 고상에서 β-연결 디사카라이드의 합성을 위한 일반 반응식을 도시한 도면.

제7도는 고상에서 α-연결 디사카라이드의 합성을 위한 일반 반응식을 도시한 도면.

제8도는 고상에서 트리사카라이드의 합성을 위한 일반 반응식을 도시한 도면.

제9도는 제1도의 모노사카라이드 1의1H NMR 스펙트럼.

제10도는 제1도의 모노사카라이드 2의1H NMR 스펙트럼.

제11도는 제1도의 모노사카라이드 3의1H NMR 스펙트럼.

제12도는 제1도의 트리사카라이드 5의1H NMR 스펙트럼.

제13도는 트리사카라이드의 아노머 부분이 표지되는 5의1H NMR 스펙트럼의 확장부를 도시한 도면.

제14도는 제1도의 디사카라이드 4의1H NMR 스펙트럼.

제15도는 시클라마이신 0의 합성을 위한 반응식을 도시한 도면.

제16도는 트리사카라이드의 합성을 위한 반응식을 도시한 도면.

제17도는 선택된 디사카라이드의 합성을 위한 반응식을 도시한 도면.

[발명의 상세한 설명]

[발명의 분야]

본 발명은 일반적으로 올리고사카라이드 및 다른 글리코콘주게이트(glycoconjugate)를 급속으로 구성하게 하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 말하자면, 본 발명은 단일 단계로 용액에서 복수 글리코시드 결합(glycosidic linkage)의 형성방법에 관한 것이다. 본 발명은 아노머 술폭시드와 친핵성 작용기를 함유한 글리코시드 잔기의 상대 반응성이 조절될 수 있다는 발견을 이용한다. 본 발명의 다른 일예에서, 활성화 아노머 슈가 술폭시드의 반응성은 글리코시드 결합의 형성을 위한 고상 방법에 이용된다. 개시된 방법은 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있는, 글리코콘주게이트를 비롯하여, 여러가지 올리고사카라이드의 혼합물로 이루어진 글리코시드 라이브러리(libraries)의 제조외에도, 특정 올리고사카라이드 및 다른 글리코콘주게이트의 제조에 적용될 수 있다.

[발명의 배경]

[일반 배경]

글리코프로테인과 글리코리피드의 올리고사카라이드 사슬은 광범위한 생화학 과정에서 중요한 역할이 있다. 세포 표면 및 생물학적 유체의 순환에서 모두 발견된, 이들 글리코시드 잔기는 정상적인 세포 발육 및 기능에서 주요 사상(key events)을 매개하는 인식 시그널로서 작용한다. 그들은 수정, 배형성, 신경 발육, 호르몬 활성, 염증, 세포 증식, 및 특이 조직으로 서로 다른 세포 형태의 조직화에 포함된다. 그들은 또한 순환에서 플라즈마 글리코프로테인의 정화외에도 글리코프로테인의 세포간 분류(sorting) 및 분비에 포함된다.

건강 관리에서 그들의 양적 역할에 더하여, 올리고사카라이드는 또한 질병의 발현에 포함된다. 예를들어, 세포 표면에서 올리고사카라이드는 보다 양성의 리간드외에, 비루스 및 톡신에 대한 리셉터(receptor)로서 작용한다. 변형된 세포 표면의 탄수화물은 종양발생 및 전이에 관계된 바 있다. 염증을 매개하고 감염 방지를 돕는 올리고사카라이드 구조는 과도한 수준으로 생성될 때, 만성 염증 질병의 발현을 자극할 수 있다(건강 및 질병에서 성숙핵에 의해 생성된 올리고사카라이드의 역할에 대한 몇가지 참조문헌은 다음을 포함한다: Hakomori TIBS, 1984, 45; Feizi et al. TIBS, 1985, 24; Rademacher et al. Annu. Rev. Biochem. 1988, 57, 785; Feizi TIBS, 1991, 84; Dennis and laferte Cancer Res. 1985, 45, 6034;Fishman J. Membr. Biol. 1982, 69, 85;Markwell et al. PNAS USA, 1981, 78, 5406; Wiley and Skehel J. Annu. Rev. Biochem. 1987, 56, 365; Kleinman et al. PNAS USA, 1979, 76, 3367; Walz et al. Science 1990, 250).

박테리아가 성숙핵으로서 동일 형태의 올리고사카라이드 또는 다른 글리코콘주게이트를 생성하지 않지만, 그럼에도 불구하고 원시핵은 광범위한 글리코실화 분자를 생성한다. 이러한 분자가 많이 분리되었고 항종양 또는 항생 활성을 가지고 있다고 발견되었다. 강력한 치료 이용성을 가진 박테리아 생성 글리코실화 분자는 크로모마이신, 칼시키아마이신, 에스퍼라마이신, 및 시클라마이신을 포함한다. 이들 모든 경우에, 탄수화물 잔기가 생물학적 활성에 중요하다고 알려진 바 있다. 그러나, 탄수화물 잔기의 정확한 기능이 잘 이해되어 있지 않으며 구조-활성 관계의 이해는 없다.

건강과 질병에서 그들의 부작용 때문에, 올리고사카라이드가 연구의 중요 초점이 된 바 있다. 올리고사카라이드의 비정상적인 기능의 몇가지를 1) 검출하고 2) 차단하거나 달리 조절하는 기술 개발이 건강 및 평안(well-being)에 있어서 중요한 개선을 유도한다는 사실이 널리 인정되고 있다. 더구나, 특이 세포 형태로 약물 분배를 비롯하여, 다른 목적을 위해 올리고사카라이드의 정상적인 기능 몇가지(예, 여러가지 인식 과정)를 개발할 수 있어야 한다. 이에 더하여, 합성 글리코실화 분자로부터 글리코실화 박테리아 항종양제를 암시하는 새로운 항종양제를 개발할 수 있다.

여러가지 질병에 관련된 탄수화물을 검출하기 위한 진단 키트, 세포 표면 탄수화물을 인식하는 비루스에 의한 감염을 차단하는 백신, 탄수화물 리셉터를 인식하는 약물 분배 부형제, 및 약물로서 사용하기 위해, 비정상적인 탄수화물을 인식하는, 일클론 항체를 비롯하여, 올리고사카라이드에 관련된 제품을 개발하려는 노력이 기울여지고 있다. 이들 및 다른 탄수화물-기재 생의학적 제품의 적절한 개발은 차례로 올리고사카라이드 및 다른 글리코콘주게이트를 기본적으로 개발적인 연구를 위해 신속하게, 효율적으로, 및 실제적인 양으로 생성하는 기술의 이용성에 따른다.

구체적으로, 다음에 특정 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 여러가지 올리고사카라이드 또는 다른 글리코콘주게이트의 혼합물로 이루어진 글리코시드 라이브러리를 신속하게 제조하게 하는 방법에 대해 필요하다. 예를들어, 펩티드 혼합물의 스크리닝이 활성 화합물을 확인하고 구조-활성 관계를 설명하는 효과적인 방식이라고 알려진 바 있다. 펩티드의 화학적으로 다양한 혼합물을 생성하고 활성 화합물을 측정하는 여러가지 방식이 있다 (참조예, Furka et al. Int. J. Petide Protein Res. 1992, 37, 487; Lam et al. Nature 1991, 354, 82; Houghton Nature 1991, 354, 84; Zuckermann et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 4504; Petithory Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991, 88, 11510; Geyse Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3998; Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 5131; Fodor Science 1991, 251, 767). 스크리닝 목적을 위한 올리고사카라이드 및 다른 글리코콘주게이트의 다양한 혼합물을 생성하는 효과적인 방법을 알고 있지 못하다.

[안트라시클린(anthracyclines)]

스트렙토마이세스 카포아무스로부터 분리된 안트라시클린 항생제, 시클라마이신 0(1, 아래)은 실험 종양에 대해 높은 억제성 생체 활성을 가지고 있다. 이 약물은 아글리콘 ε-피로마이시논 및 트리사카라이드로 구성된다 (참조, Biebar et at. J. Antibiot. 1987, 40, 1335). 트리사카라이드는 2-데옥시-L-푸코스(A, B)의 두개 반복 단위와 케토 슈가(C), L-시네룰로스의 일단위를 함유한다. 모든 슈가는 서로 1-4 축 결합을 통해 연결된다.

시클라마이신이 거의 30년전에 발견되었지만, 천연원료로부터 충분한 양이 이용될 수 없으므로 그의 기능에 대해 거의 이해되고 있지 않다. 결론적으로, 시클라마이신을 많은 양으로 얻는 가장 좋은 방법, 및 그의 동족체를 얻는 유일한 방법은 화학적 합성에 의한 것이다.

시클라마이신의 아글리콘, ε-피로마이시논은 쉽게 이용될 수 있는 다른 항생제, 이를테면 마르셀로마이신(marcellomycin), 무셋타마이신(musettamycin) 및 시네루빈(cinerubin)의 탈글리코실화에 의해 얻어질 수 있다(참조예, Kolar et al. Carbohydr. Res. 1990, 208, 111). 그러나, 트리사카라이드의 구성 방법은 전체적인 용이성과 효율의 한정을 일으킨다.

안트라시클린 항생제는 여러가지 스트렙토마이세스종의 대사작용에서 중간체로서 발생된다. 그들은 여러가지 충실성 종양과 백혈병의 치료에서 광범위하게 사용된 강력한 화학 치료 약물이다(참조, Arcamone, F. Doxorubiein Anticancer Antibiotics; Acadenic Press: New York, 1981). 모든 안트라시클린의 아글리콘은 작용화 시클로헥산 성분을 가진 트리시클릭 퀴닌오이드로 구성된다. 아글리콘 중에서 빈번히 조우된 여러가지 치환 패턴이 다음에 요약된다.

모든 안트라시클린 항생제의 통상적인 형상은 아글리콘의 C-7 히드록실기에 결합된 올리고사카라이드 잔기이다. 이 지점에서 슈가 잔기는 모노, 디 또는 트리사카라이드일 수 있다. 가장 빈번하게 만난 슈가는 다우노사민, 로도사민, 2-데옥시-L-푸코스 및 L-시네룰로스를 포함한다.

안트라시클린 항생제 다우노마이신, 아드리아마이신, 및 아클라시노마이신에 대해 수행된 여러가지 연구를 기초로, 이들 천연 DNA 결합제의 올리고사카라이드 성분이 DNA 결합 및 인식에 중요한 역할이 있다는 것이 점차 명백해진 바 있다(참조, Bieber et al, 상기인용문). 그러나, 이들 약물을 선택적으로 변형시키는 것이 어렵기 때문에 부분적으로, 슈가의 실제 기능에 대해 거의 알려져 있지 않다. 시클라마이신 0의 처음 화학적 합성이 S.J.Danishefsky 및 그의 공동연구가에 의해 성취되었다(참조, Suzuki et al.J.Am.Chem.Soc.1990, 1112, 8895).

[2-데옥시 올리고사카라이드의 합성]

안트라시클린과 아우레올린산과 같이 착물 글리코콘주게이트는 과학적이고 약제학적인 관심이 상당하며 암 화학치료에서 광범위하게 적용된 바 있다. 이들 화합물에서 통상의 구조 형상은 2-데옥시 올리고사카라이드의 존재이다. 실제, 여러가지 형태의 알파- 및 베타-2-데옥시글리코시드가 천연 발생 생활성 분자에서 빈번히 발견되고 있다. 아우레올린산 항생제 및 안트라시클린 항생제에 더하여, 심장제 글리코시드, 아베르멕틴, 에리트로마이신, 및 에네다인 항생제가 발견될 수 있다. 이들 2-데옥시 글리코시드, 특히 2-데옥시-β-글리코시드의 효과적인 구성이 탄수화물 화학에서 오랜 문제점인 바 있다. 2-데옥시 슈가에서 β 입체선택성 조절은 C-2 위치로부터 입체-지시 안키메릭(anchimeric)보조가 있을 수 없으므로 어렵다.

일반적으로, 이들 약물의 특정 치료 효과가 아글리콘에 의해 야기된다고 생각되며, 반면에 슈가는 약동학을 조절하는데 책임이 있다고 생각된다. 탄수화물 성분을 개질함으로서, 효능을 증가시키고 또한 이들 약물의 세포독성을 감소시킬 수 있다.

슈가 동족체의 개발은 2-데옥시 올리고사카라이드의 구성을 위한 양호한 합성 방법을 필요로 한다. 불행히도, 2-데옥시 올리고사카라이드의 합성에 이용될 수 있는 글리코실화 방법이 일반적으로 만족스럽지 못하다. 2-데옥시 글리코실 도너(donor)는 C-2 위치에 치환체가 결핍되어 있으므로, 그들은 안정하지 못하다. 그들은 대부분의 글리코실화 반응에서 신속히 분해되며, 이로서 글리코시드의 수율이 열악해진다.

사실상, 2-데옥시 올리고사카라이드를 구성하기 위한 보다 양호한 현존 방법중 한가지인, 글리칼법은 2-데옥시 글리코실 도너를 실제로 직접 사용하지 않음으로서 이러한 문제를 해결한다. 이 과정은 2-데옥시 글리코시드를 구성하기 위해 가장 널리 사용된 글리코실화 방법중 한가지이며, 이단계 과정을 포함한다. 제일 단계에서, 1,2-안히드로 슈가(글리칼)를 적합한 친전자체, E+로서 처리하여 1,2-오늄 중간체를 형성한다. 반대면으로부터 친핵성 공격은 글리코시드에 1,2-트란스-형태의 결합을 부여한다. 제이 단계에서, C-2에서 치환체를 제거하여 원하는 2-데옥시 글리코시드를 형성한다.

[올리고사카라이드를 얻는 용액법]

현재 올리고사카라이드를 얻는 두가지 일반적인 방법이 있다. 첫번째는 천연원으로부터 분리에 의한 것이다. 이러한 접근은 대량으로 생성되는 천연 발생 올리고사카라이드에 한정된다. 제이 방법은 효소 또는 화학적 합성을 통한 것이다. 효소 합성을 통해 이용될 수 있는 여러가지 올리고사카라이드는 사용된 효소가 단지 어떠한 기질을 허용할 수 있기 때문에 한정된다. 화학적 합성은 효소 합성 보다 신축성이 있으며 크게 다양한 올리고사카라이드를 생성하는 포텐셜이 있다. 화학적 합성이 가진 문제점은 시간과 노동면에서 매우 비싸다는 것이었다. 이러한 문제점은 올리고사카라이드의 화학적 합성이 현재까지 수행된 방식의 결론이다.

올리고사카라이드는 글리코시드 결합에 의해 연결된 모노사카라이드로부터 형성된다. 올리고사카라이드의 전형적인 화학적 합성에서, 완전히 보호된 글리코실 도너가 활성화되고 용액에서 글리코실 수용액(acceptor)(전형적으로 비보호 히드록실기를 가진 다른 모노사카라이드)와 반응시킨다. 글리코실화 반응 자체는 사용된 방법에 따라, 수분 내지 수일간 걸릴 수 있다. 그후 커플링된 제품을 정제하고 화학적으로 변형시켜 그것을 글리코실 도너로 전환시킨다. 화학적 변형은 몇가지 단계를 포함할 수 있으며, 각 단일 단계는 후속 정제를 필요로 한다(“단일 단계”는 중간 분리 또는 정제 단계에 대한 필요성 없이 “단일”반응관에서 수행된 화학적 변형 또는 변형 세트로서 정의된다). 각 정제는 시간을 소비하며 재료의 상당한 손실을 초래할 수 있다. 새로운 글리코실 도너, 디사카라이드를 그후 다른 글리코실 수용체에 커플링시킨다. 그후 생성물을 분리하고 이전과 같이 화학적으로 변형시킨다. 트리사카라이드 합성이 성분 모노사카라이드로부터 10 또는 그 이상의 단계를 필요로 하는 것은 통상적이지 못하다. 최근의 한가지 일예에서, 시클라마이신 0 으로 불린 항종양 항생제의 완전 보호된 트리사카라이드 측쇄를 모노사카라이드 성분에 기초하여 9% 수율로 14 단계로 합성하였다(참조, Suzuki et al, 상기인용문). 따라서, 올리고사카라이드의 합성에 포함된 시간 및 경비는 탄수화물 약물 및 다른 생의학 제품의 개발에 심각한 방해가 된 바 있다.

올리고사카라이드 합성의 속도 및 효율을 증가시키는 한가지 방법은 단일 단계로 복수 글리코시드 결합을 구성하게 하는 방법을 개발하는 것이다. 현 발견전에, 발명자들은 복수 글리코시드 결합의 부분 선택적(regioselective) 형성을 포함하고 올리고사카라이드의 생성을 위해 신속하고, 효율적이며 고수율의 방법을 제공하는 일단계 방법을 알고 있지 못했다.

[올리고사카라이드의 고상 합성]

올리고사카라이드의 합성에 포함된 단계의 수를 감소시키는 것외에, 또한 분리 및 정제에 대한 필요성을 제거함으로서 합성 방법의 속도 및 효율을 증가시킬 수 있다. 이론적으로, 분리 및 정제에 대한 필요성의 제거는 올리고사카라이드의 합성을 위한 고상 방법을 개발함으로서 성취될 수 있었다.

고상 합성의 강력한 장점의 중요성으로 인해, 고상으로 올리고사카라이드를 합성하려는 이전의 연구가 있었다. 고상 합성방법은 과량의 시약과 분해 생성물이 수지-결합 생성물로부터 간단히 씻길 수 있으므로 분리 및 정제가 불필요하다. 이러한 장점은 시간, 노동, 및 수율면에서 막대한 절약으로 전이된다(펩티드 및 헥산의 합성을 위한 용액법에 비해 고상 방법의 장점은 충분히 제시된 바 있다. 이들 장점은 물론 올리고사카라이드의 고상 합성으로 확대된다(펩티드의 고상합성에 대해, 참조예, Barany, G. and Merrifield, R. B. 1980, in the Peptides, Gross, E. and Meienhofer, J. Eds., Acadenic Press, New York, Vol 2, pp. 1-284).

1971년으로 되돌아가서, Frechet와 Schuerch는 고상 올리고사카라이드 합성에 대한 조건을 요약하였다(참조, Frecht and Schuerch J. Am. Chem. Soc. 1971, 93, 492). 첫째, 수지는 반응 조건에 적합하여야 한다. 둘째, 고체 지지체는 글리코시드 중심(또는 그외의 곳)에 링크(link)를 제공하는 적합한 작용성을 함유해야 하며, 링크는 반응 조건에 불활성이나 쉽게 분해되어 합성 완료시 올리고사카라이드를 제거할 수 있다. 세째, 적합한 보호기 반응식이 가동되어 특정 히드록실이 다음 커플링 반응을 위해 선택적으로 비차폐될 수 있어야 한다. 나머지 히드록실은 “영구”차단기에 의해 보호되어 합성 종료시에 제거되어야 한다. 네째, 글리코실화 반응은 효율적이고, 온화해야 하며 실패 시퀀스를 피하도록 완료되어야 한다. 다섯째, 아노머 중심의 입체화학이 커플링 사이클중에 유지되어야 하며 제공된 도너/수용체 쌍에 대해 용액에서 얻어진 결과를 기초로 예상될 수 있어야 한다. 여섯째, 영구 차단기의 분해 및 폴리머에 대한 링크는 올리코사카라이드를 손상시키지 않고 남겨야 한다.

불행히도, 고상 올리고사카라이드 합성이 바람직한 목표라고 일반적으로 받아들여지고 있지만, 그리고 Frechet와 Schuerch(그외에 다른 사람들)는 고상 올리고사카라이드 합성에 대한 전략을 요약할 수 있었지만, 본 발견전에, 아무도 이러한 전략을 만족시킬 수 없었다. 불용성 수지에서 올리고사카라이드를 합성하는 이전의 연구에서, 커플링 수율은 낮고 입체화학적 조절은 특히 β-글리코시드 결합(즉, 슈가의 아노머 위치에서 글리코시드 결합이 C-2에서 슈가 치환체를 생성한 결합에 트란스인 1,2-트란스 글리코시드 결합)에 대해 부적합하였다.

이들 문제점은 고상에서 반응 속도가 용액에서 보다 느리다는 사실로 인한 것이었다(참조, Eby and Schuerch, Carbohydr. Res. 1975, 39. 151). 이러한 바람직하지 못한 속도론의 결과는 용액에서 아주 유용하게 수행될 수 있는, 대부분의 글리코실화 반응이 단순히 입체화학적 조절과 수율면 모두에서 고상으로 잘 수행되지 못한다는 것이다. 따라서, 예를들어, 두가지 모두 촉매의 존재하에 아노머 할라이드의 치환을 포함하는, 두가지 글리코실화 반응은 용액에서 우세하게 β-아노머(즉, 1,2-트란스 생성물)를 제공하나 고상에서 혼합물을 제공한다는 것을 Frechet와 Schuerch는 발견하였다. Frechet와 Schuerch는 고상에서 β-글리코시드 결합을 형성하기 위해 인접 기의 참여를 이용하는 것이 필요하다고 결론지웠다.

그러나, 다시, 현존 글리코실화법이 고상에 채택될 수 없다는 점에서 인접 참여기(neighboring participationg groups, NPGs)가 빈번히 글리코실 도너를 불활성화한다고 발견되었다. 글리코실 도너는 글리코실화가 발생될 수 있기전에 수지 혼합물에서 자주 분해된다(참조, Eby and Schuerch, 상기인용문). 몇가지 일예에서 수지는 또한 글리코실화에 필요한 조건의 가혹함으로 인해 분해된다고 알려진 바 있다. 또한, 많은 에스테르-형 NPG에 대해, 글리코실 도너로부터 수지위 유리 글리코실 수용체로 아실 전이로서 중요한 문제점이 존재한다. 이러한 부반응은 수지를 덮고(cap) 추가 반응을 방지한다.

Frechet는 고상 올리고사카라이드 합성에 대한 전략을 실행하려는데 조우된 문제점을 검토한 바 있다(참조, Frechet, Polymer-supported Reactions in Organie Synthesis, p. 407, P. Hodge and D. C. Sherrington, Eds. John Wiley ＆ Sons, 1980). 그는 고상 올리코사카라이드 합성이 “주로 적합한 글리코실화 반응의 결핍으로 인해”용액 합성과 아직 경쟁적이지 못하다고 결론지웠다.

가용성 수지를 사용함으로서 고상 반응과 관련된 바람직하지 못한 반응 속도론을 극복하려는 노력이 있었다. 지금까지 가장 좋은 일예로 Douglas와 그의 공동연구가들은 숙신산 링커와 함께 가용성 폴리에틸렌 글리콜 수지를 사용하였고 80년간에 걸쳐 알려진 글리코실화법(Koenigs-Knorr 반응)을 이용하여 우수한 아노머 입체화학의 조절과 함께 커플링 수율 85-95%를 얻었다(참조, Douglas et al. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 5095). 가용성 수지는 보다 “용액적인”환경을 제공하므로 몇가지 글리코실화 반응에 대해 바람직할 수 있다. 그러나, 가용성 폴리머에서 단계별 합성은 각 단계후에 중간체가 침전되고 또다른 슈가 잔기가 커플링될 수 있기전에 결정화되어야 하는 것을 필요로한다.

더구나, 전형적으로 반응을 완료시키는데 동일한 글리코실화제의 수회 첨가가 필요하다. 상기 경우에, 예를들어, Douglas외 그의 공동연구가들은 높은 수율을 얻기 위해 동일한 커플링 반응을 5회 반복해야 했다. 각 반복은 시약을 씻어 버리는 침전 단계를 필요로 한다. 생성물이 각 침전 단계로서 상실될 수 있다. 이에 더하여, 반복된 침전은 공정을 시간-소모적으로 만든다. 따라서, 올리고사카라이드 합성에 가용성 수지 방법은 불용성 수지를 이용하여 고상 합성과 관련된 모든 강력한 장점을 제공하지 못한다.

아노머 슈가 술폭시드를 포함한 글리코실화의 새로운 방법이 Kahne 과 공동연구가에 의해 보고되었다(참조, Kahne et al. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6881). 아노머 슈가 술폭시드는 힌더드(hindered) 염기의 존재하에 무수 트리플릭산 동일 몰량으로 활성화되었다. 무수 트리플릭산 활성화 글리코실 도너는 용액에서 반응성이 아주 크다고 입증되었고 온화한 조건하에 비반응성이 큰 기질을 글리코실화하는데 사용될 수 있었다. 그러나, 이러한 보고서는 용액 반응에 한정되었고, 고상 반응이 어느 정도 유용하게 수행될 수 있다는 제안은 없었다.

따라서, 본 기술의 상태는 올리고사카라이드의 급속, 효율적, 및 고수율 합성을 갖춘 글리코실화법에 대해 널리 행해지고 충족되지 않은 필요성을 강조한다. 더구나, 고상에서 올리고사카라이드의 효율적인 합성은 고상법의 이전에 언급된 모든 장점을 제공한다고 제시되어 있지 않았다.

[본 발명의 요지]

본 발명은 아노머 결합의 입체화학 형태에 대해 조절되는, 글리코실 도너로서 아노머 슈가 술폭시드를 이용하여 용액에서 복수 글리코시드 결합을 구성하고 고상에서 연속적인 글리코시드-결합을 구성하는 방법을 제공한다. 따라서, 선택된 조건과 출발 물질에 따라, α-또는 β-아노머가 글리코실 도너로서 아노머 슈가 술폭시드를 이용하여 고상에서 생성될 수 있다. 본 발명의 방법은 후속적으로 스크리닝되어 원하는 생물학적 활성을 가진 화합물을 검출할 수 있는 글리코시드 라이브러리의 생성을 위한 특정 올리고사카라이드 또는 글리코콘주게이트의 제조 또는 여러가지 올리고사카라이드 또는 글리코콘주게이트의 혼합물의 제조에 적용될 수 있다.

본 발명은 또한 촉매량의 활성제로서 아노머 술폭시드의 활성화가 매우 온화한 조건하에 매우 양호한 수율의 축합 생성물을 제공한다는 발견에 관한 것이다. 바람직하게도, 활성제는 강 유기산, 이를테면 트리플루오로메탄술폰산 또는 “트리플릭”산(TfOH), p-톨루엔술폰산(TsOH) 또는 메탄술폰산(MsOH)이며, 가장 바람직하게는 TfOH이다. 특히, 2-데옥시 글리코시드의 구성을 위해, 본 발명에서 기재된 촉매 글리코실화 방법이 선택 방법으로서 고려된다는 사실이 발견된 바 있다. 트리플릭산-촉매화 글리코실화에 의해 2-데옥시 글리코시드의 합성을 포함한, 본 발명의 이러한 양상의 바람직한 일예가 다음에 보다 상세히 기술된다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명의 개시 내용을 고려하여 통상의 숙련가에게 명백할 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 성분 모노사카라이드로부터 일단계로 시클라마이신 0의 보호 트리사카라이드를 합성하는 방법을 도시한다.

제2도는 일단계로 2-데옥시 푸코스의 호모폴리머를 형성하는 방법을 도시한다.

제3도는 DNA 결합 활성을 비롯하여, 생물학적 활성을 가진 글리코콘주게이트의 혼합물을 합성하는 방법을 도시한다. 이와 같이 제조된 글리코콘주게이트를 이어서 스크린닝하여(예, DNA 결합 활성에 대해) 시험된 활성을 기초로 글리코콘주게이트의 올리고사카라이드 부분의 바람직한 길이 및 바람직한 슈가 잔기를 평가할 수 있다.

제4도는 고체 지지체(예, 폴리스티렌 수지)로부터 결합의 두가지 실예 형태를 형성하고 제거하는 방법을 도시한다.

제5도는 고상 올리고사카라이드 합성을 수행하는데 사용된 장치를 도시한다.

제6도는 고상에서 β-연결 디사카라이드의 합성을 위한 일반 반응식을 도시한다.

제7도는 고상에서 α-연결 디사카라이드의 합성을 위한 일반 반응식을 도시한다.

제8도는 고상에서 트리사카라이드의 합성을 위한 일반 반응식을 도시한다.

제9도는 제1도의 모노사카라이드 1의1H NMR 스펙트럼이다.

제10도는 제1도의 모노사카라이드 2의1H NMR 스펙트럼이다.

제11도는 제1도의 모노사카라이드 3의1H NMR 스펙트럼이다.

제12도는 제1도의 트리사카라이드 5의1H NMR 스펙트럼이다.

제13도는 트리사카라이드의 아노머 부분이 표지되는 5의1H NMR 스펙트럼의 확장부를 나타낸다.

제14도는 제1도의 디사카라이드 4의1H NMR 스펙트럼이다.

제15도는 시클라마이신 0의 합성을 위한 반응식을 나타낸다.

제16도는 트리사카라이드의 합성을 위한 반응식을 나타낸다.

제17도는 선택된 디사카라이드의 합성을 위한 반응식을 나타낸다.

[본 발명의 상세한 설명]

다음은 본 발명의 바람직한 일예의 상세한 설명이다.

[정의]

활성화제: 글리코실 술폭시드에 첨가시 아노머 술폭시드기와 반응하며, 따라서 친핵성 공격에 감수성이 있는(susceptible) 아노머 탄소를 부여하는 화학 약품, 이작용성 슈가 또는 글리코시드 잔기의 경우에, 활성화제가 또한 아노머 술폭시드기를 활성화하는데 사용된 동일한 조건하에 차단된 친핵성 기를 탈보호할 수 있다.

산 스케빈저(scavenger): 프로톤을 봉쇄하며, 이로서 산성 조건에 의해 촉진되는 부반응을 최소화하는 염기와 같은 화학 약품.

술펜산 스케빈저: 특히 술펜산을 봉쇄하여, 전형적으로 비반응성 모노페닐, 술폭시드의 형성을 초래하는 메틸 프로피올레이트와 같은 화학 약품, 술펜산 스케빈저의 부존재하에, 술펜산 자체가 반응하여 디페닐 디술파이드 모노술폭시드와 물을 형성한다. 물은 글리코실화 반응을 방해한다.

이작용성: 본 발명의 단일 단계 공정의 조건하에 글리코실 도너 및 글리코실 수용체 두가지 다로서 활성화시 작용할 수 있는 슈가 또는 글리코시드 잔기의 특성.

생물학적 활성: 강력한 생리적, 약리적, 진단, 또는 치료 적용을 가진 화합물 또는 분자에 의해 나타난 활성.

탄수화물 리셉터: 탄수화물을 결합하는 분자. 전형적으로 분자는 프로테인 또는 DNA와 같은 매크로분자이다.

글리코콘주게이트: 글리코시드 잔기에 공유결합되어 있는 화합물 또는 분자.

글리코시드: 아노머 탄소가 비수소 치환체를 생성하는 펜토스 또는 헥소스 적어도 한가지를 함유한 슈가. 전형적으로, 비수소 치환체는 헤테로원자, 이를테면 질소, 산소, 인, 실리콘 또는 황이다.

글리코실 수용체: 본 발명의 단일 단계 공정의 조건하에, 글리코실 도너의 아노머 탄소와 공유결합을 형성할 수 있는 적어도 한가지의 친핵성 기를 함유한 화합물. 본 발명에서 언급된 것으로서, 글리코실 수용체는 비보호 히드록실, 아미노, 또는 메르캅토 기 또는 제자리에서 제거될 수 있는 보호기, 즉 본 발명의 단일 단계 공정의 조건하에 차단되는 기를 함유하는 슈가 또는 글리코콘주게이트이다.

글리코실 도너: 활성화시 기가 글리코시드 결합을 형성하도록 글리코실 수용체의 친핵성 기에 의한 공격에 감수성이 있는 아노머 탄소를 부여하는, 아노머 탄소에서 술폭시드 기를 생성하는 슈가 또는 글리코시드 잔기.

글리코시드 라이브러리: 스크리닝 과정에 수행되어 생물학적 활성을 나타내는 화합물 또는 분자를 확인할 수 있는 시퀀스를 변화시키는 올리고사카라이드의 혼합물. 이러한 라이브러리는 또한 다양한 글리코콘주게이트를 함유할 수 있다.

일작용성 글리코실 수용체: 동시에 글리코실 도너로서 작용하는 능력(즉, 본 발명의 단일 단계 공정의 조건하에)이 특히 제외되는 추가조건을 가진, 상기 정의에서 처럼 글리코실 수용체.

일작용성 글리코실 도너: 동시에 글리코실 수용체로서 작용하는 능력(즉, 발명의 단일 단계 공정의 조건하에)이 특히 제외되는 추가 조건을 가진, 상기 정의에서 처럼 글리코실 도너.

일작용성 글리코실 유니트: 글리코실 수용체 또는 글리코실 도너이나 본 발명의 단일 단계 공정의 조건하에 활성화시 두가지 다로서 작용하는 능력을 가지고 있지 않은 슈가.

올리고사카라이드: 글리코시드 결합에 의해 결합된 세개 또는 그 이상의 모노사카라이드 유니트를 가진 글리코시드 잔기.

강력한 글리코실 수용액: 글리코실 도너의 아노머 탄소와 공유결합을 강력하게 형성할 수 있는 적어도 한가지의 친핵성 기를 함유한 화합물.

단일 단계 반응: 단일 단계 반응은 중간 분리 또는 정제 단계에 대한 필요성 없는 “단일”반응관(즉, 일단계 또는 일포트 반응)에서 수행된 화학적 변형 또는 변형 세트로서 정의된다.

임시 보호기: 바람직하게는, 그러나 필수적이지는 않지만, 아노머 술폭시드 기를 활성화하는데 사용된 동일 조건하에, 제자리로 제거될 수 있는 차단 또는 보호기.

[일반 방법]

다음 일반 방법은 두가지 주 카테고리로 분리되었다: 첫째는 복수 글리코시드 결합의 형성을 포함한 용액 반응에 관한 것이며 둘째는 성장 올리고머가 고체 지지체에 결합되는 올리고사카라이드의 합성에 관한 것이다.

[용액에서 복수 글리코시드 결합의 형성]

아노머 위치에 알킬 또는 아릴 술폭시드를 가진 한가지 또는 그 이상의 글리코실 도너 및 한가지 또는 그 이상의 유리 히드록실 및/또는 다른 친핵성 기(예, 아민) 및/또는 실릴 에테르 보호 히드록실을 가진 한가지 또는 그 이상의 글리코실 수용체를 반응관에서 결합시킨다. 얻어진 혼합물은 이작용성 글리코실 유니트외에 일작용성 글리코실 도너와 글리코실 수용체 두가지 모두, 즉 동시에 글리코실 도너와 수용체로서 작용할 수 있는 사카라이드를 포함할 수 있다. 그러나, 한가지 이상의 글리코시드 결합을 형성하기 위하여(즉, 트리사카라이드 또는 보다 긴 생성물을 생성하기 위하여), 적어도 한가지의 반응체가 이작용성 글리코실 유니트이어야 한다.

글리코실 수용체 및 도너는 한가지 또는 그 이상의 위치에 에테르, 에스테르, 아세트아미도, 또는 티오에스테르 보호기를 포함하나, 이에 국한하지 않는, 적합한 보호기에 의해 차단될 수 있다. 그러나, 글리코실 도너의 C-2에서 에스테르(또는 아세트아미도 또는 티오에스테르) 보호기가 1,2-트란스 글리코시드 결합을 얻는, 글리코실화의 입체 화학적 성과에 영향을 미칠 것이라고 이해된다.

글리코실 도너와 수용체의 혼합물을 톨루엔, 에테르, 테트라히드로푸란(TIIF), 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 프로피오니트릴, 또는 그의 혼합물을 포함하나, 이에 국한하지 않는, 비친핵성 용매에서 무수 조건하에 용해시킨다. 용매의 선택은 인접기 참여가 포함되지 않은 반응에 대해 글리코실화의 입체화학적 성과에 영향이 있다고 발견된 바 있다. 일반적으로, 제공된 도너/수용체 쌍에 대해, 비극성 용매, 이를테면 톨루엔의 사용은 보다 높은 퍼센트의 알파 이성체의 형성을 초래하며, 반면에 보다 극성인 용매, 이를테면 프로피오니트릴의 사용은 보다 높은 퍼센트의 베타 아노머의 형성을 초래한다.

반응은 활성화제의 유효량을 첨가함으로서 개시된다. 본 발명의 특정 일예에서, 무수 트리플릭산 0.5 당량, 플러스 염기(산 스캐빈저로서) 1.5 당량을 반응 혼합물에 첨가한다(당량은 글리코실 술폭시드에 관한 것임). 촉매량의 트리플릭산(예, ＜0.05 당량)을 또한 바람직하게는 과량의 술펜산 스케빈저(예, 메틸 프로피올레이트 약 20 당량)와 다같이 사용할 수 있다. 반응 혼합물이 2-데옥시 글리코실 도너를 함유할 때 또는 반응에서 글리코실 수용체의 한가지가 실릴 에테르일 때 촉매트리플릭산이 바람직하다고 발견된 바 있다. 다른 한편, 글리코실 도너의 최대 반응성이 중요할 때 무수 트리플릭산이 바람직하다. 그러나, 무수 트리플릭산의 사용으로서 얻는 보통의 염기성 조건이 실릴에테르(예, t-부틸실릴 에테르)를 탈보호하는데 효과적이지 못하다는 사실에 주목해야 한다. 더구나, 무수 트리플릭산 플러스 2,6-디삼차부틸-4-메틸피리딘의 사용이 트리메틸실릴 에테르의 제자리 탈보호를 초래할 것이지만, 무수 트리플릭산 플러스 강염기(이를테면 Hunig 염기)의 사용은 탈보호를 초래하지 않을 것이다. 따라서, 무수 트리플릭산이 단지 특정 세트의 조건(염기 선택, 실릴 보호기 선택)하에 수행되지만, 활성화제 두가지 모두를 실릴 에테르 보호 히드록실을 함유한 이작용성 글리코실 유니트를 포함한 반응에 사용할 수 있다. 달리, 두가지 활성화 방법이 통상적으로 서로 교환될 수 있다.

메틸 프로피올레이트 또는 다른 술펜산 스케빈저 및/또는 활성화 분자망을 활성화제의 첨가전에 또는 바로후에 반응에 첨가할 수 있다. 술펜산 스케빈저는 촉매 트리플릭산이 활성화제로서 사용될 때 글리코실화의 수율을 상당히 개선시킨다.

반응은 통상적으로 낮은 온도(바람직하게는 약 -78℃ 내지 약 -100℃ 만큼 낮게)에서 수행되며 상온과 같이 따뜻한 몇가지 경우에, 보다 높은 온도에서 수행시킬 수 있다.

반응은 바이카보네이트 수용액의 첨가에 의해 냉각되고 추출된다. 그후 반응 혼합물을 정제 과정에 수행하며 및/또는 필요하다면 생성물을 탈보호시킬 수 있다. 과정은 생물학적 활성을 위해 스크리닝용 특정 올리고사카라이드 또는 여러가지 올리고사카라이드 또는 다른 글리코콘주게이트의 혼합물을 구성하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 일예에서, 서로 다른 글리코실 도너의 반응성이 아노머 술폭시드의 화학 구조 및 전자 특성을 처리함으로서 조절될 수 있다는 사실이 발견된 바 있다. 이러한 처리는 부분적으로 글리코실화 반응에서 속도-제한 단계가 활성화제의 작용에 의해 술폭시드의 활성이라는 지견에 인한 것이다. 이어서 글리코실 술폭시드의 반응성은 술폭시드 산소의 친핵성을 처리함으로서 영향이 있을 수 있다는 사실을 알았다.

일반적으로, 술폭시드 산소가 친핵성이 클수록, 글리코실화 반응이 보다 빠르다. 따라서, 술폭시드에 결합된 R′기에서 전자-공여 치환체는 술폭시드 산소의 친핵성을 증가시키며 반응 속도를 가속화한다. 비교하여, 전자-제거기는 술폭시드 산소의 친핵성을 감소시키며 반응을 느리게 한다. 예를들어, 퍼벤질화 글루코실 p-메톡시페닐 술폭시드는 상응하는 미치환 페닐 술폭시드 보다 빠르게 반응하며, 반면에 퍼벤질화 글루코실 p-니트로페닐 술폭시드는 상응하는 미치환 페닐 술폭시드 보다 느리게 반응한다.

서로 다른 술폭시드의 친핵성에 영향이 있으며 따라서 서로 다른 글리코실 도너의 반응성을 처리하는 능력이 본 발명의 특정 일예에서 개발된 바 있다. 예를들어, 이러한 능력은 제1도에 도시된 바와 같이, 용액에서 연속 글리코실화가 발생되게 한다.

본 발명의 다른 일예에서, 복수 글리코시드 결합은 실릴화 글리코실 수용체를 이용하여 용액에서 형성된다. 실릴 에테르는 촉매 트리플릭산이 활성화제일 때 우수한 글리코실 수용체이며 트리메틸실릴 에테르는 무수 트리플릭산이 활성화제이고 2,6-디삼차부틸-4-메틸피리딘이 염기일 때 글리코실 수용체로서 아주 좋다. 그러나, 그들은 커플링하기 위하여 차폐되서는 안된다(따라서 실릴 에테르가 글리코실 수용체로서 사용될 때 글리코실화 반응에서 약산성 조건에 대한 필요). 실릴 에테르가 커플링하기 위해 비차폐되어야 하므로, 그들은 비보호 알코올 보다 느리게 반응한다. 이러한 방식으로, 실릴 보호기의 선택적 사용에 의해 두가지 다른 유사 글리코실 수용체의 반응성을 조절할 수 있다고 제시된 바 있다.

본 발명의 선택된 일예에서, 올리고사카라이드 또는 생성된 글리코콘주게이트의 글리코시드 잔기의 길이 분포는 반응 혼합물에서 이작용성 글리코실 유니트에 대한 일작용성 글리코실 수용체 및 일작용성 글리코실 도너의 비율을 변화시킴으로서 영향을 받을 수 있다. 예를들어, 반응 혼합물에서 이작용성 글리코실 유니트에 대한 일작용성 글리코실 수용체의 보다 높은 비율은 보다 짧은 길이의 폴리머를 유도한다고 알려진 바 있다. 반응체(reactant)의 총농도도 또한 길이 분포에 영향이 있다(참조, 다음 섹션 6.6 및 6.8과 제2 및 3도).

본 발명의 특정 일예에서, 반응 혼합물에 단지 두가지 또는 세가지의 서로 다른 형태의 슈가를 포함하고 글리코실 도너 및 수용체의 반응성을 조절하여 특정 올리고사카라이드를 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 이 과정의 실예가 다음 단락 6.1 및 6.6에 제공된다.

본 발명의 다른 일예에서, 생물학적 활성에 대해 스크리닝될 수 있는 라이브러리의 생성을 위한 올리고사카라이드 또는 글리코콘주게이트의 화학적으로 다양한 혼합물을 생성시키기 위하여 반응 혼합물에 여러가지 서로 다른 형태의 슈가를 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법의 실예가 다음 단락 6.6 및 제3도에 예시된다.

화학적 다양성은 혼합물에 포함된 서로 다른 슈가의 수의 조절에 의해 영향 받을 수 있다. 화학적 다양성은 또한 서로 다른 글리코실 도너/수용체 쌍이 반응하는 순서의 작용일 것이다. 서로 다른 도너/수용체 쌍이 반응하는 순서는 차례로 서로 다른 도너/수용체 쌍의 상대 반응성에 따를 것이다. 서로 다른 도너/수용체 쌍의 상대 반응성은 상기에 이미 기재된 바와 같이, 여러가지 방식으로(예, 사용된 술폭시드기의 구조를 조절하고 실릴 에테르로서 몇가지 글리코실 수용체를 보호하여 그들이 반응하는 속도를 느리게 함으로서) 조절될 수 있다.

글리코실 도너 및 수용체의 상대 반응성에 영향이 있는 다른 인자, 이를테면 슈가 링에 음성 보호기의 존재 또는 입체 방해의 존재가 또한 개발될 수 있다(참조예, Blinkley Modern Carbohydrate Chemistry Marcel Dekker, Inc: New York, 1988; 또한, Paulsen Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1982, 22, 156). 따라서, 화학적으로 다양한 혼합물을 제조하도록 복수 글리코시드 결합을 형성하는 개시된 방법의 실시에 많은 인자를 고려할 수 있다.

[아노머 술폭시드의 촉매 활성화]

본 문헌의 다른 곳에서, 아노머 술폭시드의 무수 트리플릭산 활성화가 기술되었으며, 이 글리코실화 반응의 메카니즘이 논의되었다. 무수 트리플릭산은 술폭시드와 반응하여 반응성이 매우 큰 트리플록시술포늄염을 형성한다.

염기의 존재하에, 무수 트리플릭산 반 당량이 술폭시드 완전 일 당량을 활성화하는데 충분하였다. 반응 과정중에 생성된 페닐 트리플루오로메탄술페네이트(PhSOTf)는 슈가 술폭시드의 나머지 0.5 당량을 명백히 활성화었다(참조, 아래). 실제로, 티오글리코시드를 활성화하는데 다른 사람들은 술포네이트 에스테르를 사용하였다. 예를들어, Ogawa의 그의 공동연구가들은 페닐 및 알킬 티오글리코시드를 활성화하기 위해 페닐셀레늄 트리플레이트를 사용한다(참조, Ito and Tectrhedron Lett. 1987, 28, 2723).

그러나, 염기의 부존재하에, 무수 트리플릭산 0.05 당량이하가 술폭시드 완전 일 당량을 활성화하였다. 결합된 트리플록시 페닐 술포네이트(PhSOTf)와 무수 트리플릭산이 0.1 당량 이상에 도달하지 않았기 때문에, 반응에서 생성된 몇가지 다른 종이 촉매 사이클에서 술폭시드를 활성화하였다. 문제의 촉매가 트리플릭산(TfOH)이라고 판단되었다. TfOH는 다른 글리코실 도너를 활성화하는데 다른 사람들에 의해 사용된 바 있다(참조예, 가장 최근에, Lonn Glycoconjugate J. 1987, 4, 117; Mootoo et al. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8540; Evans et al. Tetrahedron Lett. 1990, 112, 7001; and Veeneman et al. Tetrahedron Lett. 1990, 31, 1331). 또한, 산이 반응에서 재생되므로 전형적으로 단지 촉매량이 필요하다고 발견되었다.

TfOH가 아노머 술폭시드를 활성화할 수 있는 지를 측정하기 위하여, 글리코실 도너로서 퍼벤질화 글루코스 술폭시드 1 및 글리코실 수용체로서 C-6 일차 알코올 2a를 사용하여 다음 실험이 수행되었다(참조, 아래 반응식).

술폭시드 1(1.5 당량)을 메틸렌 클로라이드에서 -78℃에 트리플릭산(0.05 당량)으로 처리하였다. 이 단계에 반응물에 친핵제(1.0 당량)의 첨가가 이어졌다. 모든 술폭시드가 소모되어 생성물을 형성하고, 촉매량으로 트리플릭산이 아노머 술폭시드를 활성화한다고 제시되었다.

[메카니즘]

이론에 의해 한정되려는 것은 아니지만, 다음의 메카니즘적 해석이 관심 독자의 이익을 위해 제안된다. 촉매 트리플릭산법을 이용하여 글리코실화를 위한 입체화학 성과가 화학양론적량 무수 트리플릭산법으로 부터 얻어진 것과 일치하였다. 두가지 반응 모두가 동일한 반응성 중간체, 즉 옥소늄 이온 또는 밀봉(tight) 이온쌍에 의해 진행된다고 추측되었다.

그러나, TFOH 법으로서, 원하는 디사카라이드 3 에 대한 수율은 낮았다. 상당량의 락톨, 4, 및 1,1-다이머, 5가 부산물로서 생성되었다(참조, 아래). 이들 부산물의 특성은 본 발명자들에게 물이 반응에 존재하였다는 것을 제시하였다. 특히, 옥소늄 이온이 물에 의해 밀폐된다면(trapped), 락톨이 형성될 것이다. 그후 아노머 락톨이 다른 옥소늄 이온을 밀폐한다면, 글리코실 도너의 1,1-다이머가 형성될 것이다.

R Tf2O로서 H: R TfOH로서 Si(CH3)3

물의 형성을 방지하기 위하여, 철저한 무수 조건하에, 활성화 분자망을 이용하여, 글리코실화를 수행하였다. 그러나, 이러한 주의에도불구하고, 질량 발란스의 40%로 계산되는, 부산물의 형성이 관찰되었다. 이러한 최종 관찰은 물이 반응의 과정중에, 가능하게는 페닐 술펜산의 불균일화로부터 약간 형성된다는 것을 제시하였다.

상기 반응식에서 예시된 바와 같이, 촉매 사이클의 제일 단계는 술포늄염을 형성하는 술폭시드의 프로톤화이다. 그후 술포늄염은 페닐술펜산(PhSOH)을 제거하여 옥소늄 이온 또는 치밀한 이온 쌍을 형성한다. 친핵제는 옥소늄 이온을 트랩핑하고, 이어서 TfOH를 재생한다. 모든 촉매 사이클에서, 술폭시드 일 분자는 생성물을 형성하고 부산물로서 페닐 술펜산 일 분자를 생성한다.

술펜산은 그들의 불안정성 때문에 분리를 회피한 유기 황 화합물의 부류이다. 그들은 친전자체 및 친핵제 두가지 다로서 높은 반응성이 있다. 술펜산은 티오술피네이트 에스테르와 물로 쉽게 불균일화를 수행한다. 그들의 이중 친전자성/친핵성을 포함한, 불균일화에 대해 가정된 메카니즘이 다음에 예시된다.

[술펜산을 위한 스캐빈저의 첨가]

술펜산은 쉽게 전자 결핍 알켄 및 알킨에 첨가되어 비닐 술폭시드를 형성한다. 따라서, 이들 화합물 자체가 축합되기전에 술펜산 스케빈저로서 이들 화합물을 트랩핑할 수 있다. 술펜산을 트랩핑하는데 자주 사용된 알켄 및 알킨의 실예는 메틸 프로피오네이트, 메틸 프로피올레이트, 스티렌, 및 디메틸 디카르복실레이트를 포함한다. 상기 화합물들을 강력한 스캐빈저로서 스크리닝하였고, 메틸 프로피올레이트가 가장 효과적이라고 발견되었다.

전형적인 반응에서, 1 및 2를 메틸 프로피올레이트(20 당량)의 존재하에 TfOH로서 반응시켰다. 반응에 대한 수율은 35%(메틸 프로피올레이트의 부존재하에)에서 45%(메틸 프로피올레이트의 존재하에)로 증가되었다. 반응 수율이 증가되었지만, 상당량의 4 및 5가 아직 생성되었다. 따라서, 술펜산의 불균일화를 방지하는 추가 방식을 찾았다.

[친핵제로서 실릴 에테르의 사용]

친핵제로서 실릴 에테르 보호 알코올의 사용은 물의 빌드-업(build-up)을 추가로 최소화할 수 있다고 판단되었다. 실릴 에테르는 온화한 반응 조건하에 반응하여 원하는 디사카라이드 축합 생성물, TMSOTf 및 페닐 술펜산을 생성하였다. 그후 술펜산이 TMSOTf 와 반응하여 실릴 페닐 술페네이트(PhSOSi(CH3)3를 형성한다고 예상될 수 있었고, 이로서 트리플릭산을 재생하였다(참조, 아래). 실릴화 술페네이트가 술펜산 보다 훨씬 안정하고 쉽게 불균일화되지 않는다고 예상될 수 있으므로, 실릴화 술페네이트가 물 빌드업을 최소화하는데 도움이 된다고 판단되었다(참조, Nakamura J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 7172).

따라서, 퍼벤질화 글루코스 술폭시드 1(1.5 당량)를 메틸렌 클로라이드에서 -78℃에 트리플릭산(0.05 당량)으로서 처리하였다. 친핵제(2b)의 실릴 에테르를 반응에 첨가하였다. 완성(work-up)후에 원하는 트리사카라이드 3 을 60% 수율로 주 생성물로서 분리하였다(참조, 섹션 5.4.1.에서 제일 반응식). 따라서, 친핵제의 실릴 에테르를 이용함으로서, 반응 수율이 상당히, 즉 35%에서 60%로 증가되었다.

[2-데옥시 올리고사카라이드의 합성을 위한 촉매 방법의 응용]

후속 연구에서 술폭시드를 활성화하기 위한 촉매 트리플릭산법의 범위를 조사하였다. 표 1은 글리코실 도너로서 2-데옥시 글리코실 술폭시드의 범위를 이용하여 글리코실화를 위한 촉매 트리플릭산 및 화학양론적 무수 트리플릭산의 비교를 보여준다.

2-데옥시 글리코실 술폭시드는 불안정하다고 널리 알려져 있으며 낮은 수율의 커플링된 생성물을 제공하는 경향이 있다(참조, 표 1). 술폭시드를 활성화하는 화학양론적 무수 트리플릭산법은 2-데옥시 글리코실 도너로서 항상 양호한 결과를 제공하지 않는다. 그러나, 촉매 트리플릭산법은 아마도 온화한 반응 조건이 2-데옥시 술폭시드의 분해를 최소화하므로, 매우 잘 수행된다. 사실, 트리플릭산의 사용은 시험된 모든 경우에 적어도 50% 정도로 글리코실화 수율을 증가시킨다.

[표 1]

2-데옥시 글리코시드의 합성

aR Ⅱ, 무수 트리플릭산으로서; R=OSi(CH3)3, 트리플릭산으로서.

표 1에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, 촉매 글리코실화법으로부터 얻어진 수율은 여러가지 글리칼법을 위해 문헌에서 보고된 가장 좋은 수율에 비교할만하다. 또한, 촉매 TfOH는 산 과민성 작용기(표 1, 엔트리 2)의 존재하에 조차 술폭시드를 활성화하는데 사용될 수 있다.

[술폭시드 활성화를 위한 촉매 TfOH 및 화학양론적 Tf2O 법의 일예]

두가지 글리코실화 방법은 서로 보충된다. 촉매 트리플릭산법은 술폭시드가 불안정할 때 유용하다. 반응 조건은 온화하며; 따라서, 글리코실 도너의 분해가 최소화된다. 또한, 글리코실화에 대해 수율 감소를 초래할 수 있는, 친핵제의 트리플레이션 또는 술페닐레이션과 같은 부반응이 촉매 TfOH법으로서 일어나지 않는다. 그러나, 술폭시드를 활성화하기 위한 촉매 트리플릭산법은 또한 상당히 느리며 무수 트리플릭산법에 비교하여 약간 높은 온도(-78℃ 내지 -30℃)를 필요로 한다. 추가로, 촉매법은 전자-제거 보호기가 글리코실 도너에 존재할 때 효과적이지 못하다.

다른 한편, 화학양론적 Tf2O 글리코실화법은 전자-제거 보호기로서 글리코실 도너에 대해 매우 잘 수행된다. 입체선택성을 얻는데 인접기 참여가 이용될 때 그것은 이용될 수 있는 가장 좋은 글리코실화법일 수 있다.

주목할 중요한 점은 트리플릭산 또는 무수 트리플릭산이 사용된 반응 조건하에 아노머 페닐 술파이드를 활성화하지 못한다는 것이다(표 1. 엔트리 5). 매우 온화한 조건하에(mCPBA, CH2Cl2, -78℃ 내지 0℃) 아노머 술파이드가 술폭시드로 쉽게 전환될 수 있으므로, 두가지 방법은 올리고사카라이드 합성을 위한 반복적인 전략에 쉽게 쓰인다.

따라서, 아노머 술폭시드가 강한 유기 프로톤산, 이를테면 트리플릭산의 촉매량으로서 글리코실화를 위해 활성화될 수 있다는 사실이 알려진 바 있다. 글리코실화 반응은 매우 온화한 조건하에 진행되며 다음의 장점을 제공한다: (i) 술폭시드의 분해가 반응 조건하에 최소이며; (ii) 친핵제의 트리플레이션과 술페닐레이션의 문제가 제거된다. 이들 장점은 특히 친핵제의 술페닐레이션 또는 트리플레이션이 수지상에 성장 올리코사카라이드 사슬의 캡핑 및 따라서 합성 종료를 초래할 수 있는 고상 올리고사카라이드 합성의 내용에 있어서, 중요하다.

이러한 촉매법은 무수 트리플릭산법을 보충하며, 2-데옥시 올리고사카라이드의 구성에 특히 유용하다. 사실, 본 발명의 문헌에서 다른 곳에 기술된 바와 같이, 촉매 트리플릭산법이 시클라마이신 0의 2-데옥시 트리사카라이드의 효과적인 구성에 사용된 바 있다. 끝으로, 본 발명자들은 무수 트리플릭산 또는 트리플릭산이 사용된 반응 조건하에 아노머 페닐 술파이드를 활성화하지 않으며; 따라서, 두가지 방법 모두가 올리고사카라이드 합성을 위한 반복적인 전량에 쉽게 쓰인다는 것을 제시한 바 있다.

[안트라시클린 항생제의 합성에 단일 단계 글리코실화법의 응용]

본 발명자들은 서로 다른 아노머 페닐 술폭시드의 반응성 순서가 페닐 링의 파라 위치에 치환체를 변화시킴으로서 조절될 수 있다는 것을 발견하였다. 결론적으로, 본 발명자들은 일단계로 성분 모노사카라이드로부터 25% 수율로 입체선택적으로 합성될 시클라마이신 0 트리사카라이드를 합성하는데 성공하였다. 합성 방법이 제15도에 요약된다.

합성의 두드러진 특징은 모든 2-데옥시 글리코시드 결합을 입체 선택적으로 구성하는 촉매 트리플릭산 글리코실화법을 사용하는 것을 포함한다. 또한, 트리사카라이드는 A 링의 아노머 중심에 페닐 술파이드를 생성한다. 아노머 페닐 술파이드는 글리코실화를 위해 아노머 술폭시드를 활성화하는 조건에 대해 안정하다(“disarmed”). 그들은 온화한 조건하에 쉽게 산화될 수 있다. 따라서 술폭시드 글리코실화법이 올리고사카라이드 합성을 위해 반복적인 전략에 잘 쓰인다. 시클라마이신트리사카라이드의 A 링상의 술파이드를 mCPBA로서 상응하는 술폭시드로 산화시킨 다음 아글리콘으로 커플링하였다.

술폭시드-매개 글리코실화 반응의 속도 제한 단계는 술폭시드의 트리플레이션이라고 발견된 바 있다. 페닐 술폭시드의 반응성은 따라서 페닐 링의 파라 위치에 치환체를 변화시킴으로서 조절될 수 있다. 관찰된 반응성 경향은 다음과 같다:

p-OMe ＞ p-H ＞ p-NO2

따라서, 퍼벤질화 글루코스 파라-메톡시 페닐 술폭시드 27(2.0 eq) 및 퍼벤질화 글루코스 페닐 술폭시드 28(2.0 eq)를 CH2Cl2에서 다같이 예비혼합하고 무수 트리플릭산(1.0 eq), 염기(2.0 eq) 및 친핵제 29(2.0 eq)로서 -78℃에 처리할 때, TLC에 의해 파라-메톡시 페닐 술폭시드가 선택적으로 활성화되었다고 관찰되었다.

크로마토그래피후에 분리된 생성물은 디사카라이드(80%)와 미반응 페닐 술폭시드(＜60% 수율)를 포함하였다. 그러나, 동일 반응을 과량의 무수 트리플릭산의 존재하에 수행할 때, 술폭시드 27 및 28 두가지 모두 추측컨대 연속 방식으로 활성화되어 글리코실화 생성물을 제공하였다.

더구나, 추가의 경쟁 실험은 글리코실 수용체(친핵제)의 상대 반응성이 또한 조절될 수 있다는 것을 나타냈다. 따라서, 퍼벤조일화 2-데옥시 푸코스 페닐 술폭시드 32(2.0 eq), 친핵제31a(1.0 eq), 실릴 에테르 31b(1.0 eq), 및 염기(2,6-디-삼차부틸-4-메틸피리딘, 2.0 eq)를 CH2Cl2에서 예비혼합하고 -78℃로 냉각하였다. 이 반응 혼합물을 그후 무수 트리플릭산(1.0 eq)으로 처리하였다. 반응에 이어서 TLC는 술폭시드 32와 친핵제 31a가 소비되었고(디사카라이드를 60% 수율로 형성) 반면에 실릴 에테르 31b는 미반응으로 남았다고 제시되었다.

다른 실험에서, 과량의 술폭시드 32(5.0 eq)를 사용하였고; 이 경우에, 친핵제 31a가 처음에 소비되고 이어서 실릴 에테르 31b가 소비되었다. 따라서, 실릴 에테르는 추측컨대, 그들이 처음에 비차폐되어야 하므로, 글리코실 수용체로서 비보호 알코올 보다 느리게 반응한다.

글리코실 도너 및 글리코실 수용체 모두의 반응성을 조절하는 능력을 알았을 때, 시클라마이신 트리사카라이드의 합성을 제15도에 따라 실행하였다. p-메톡시 페닐 술폭시드 B가 처음에 활성화되고, 그것을 A의 C-4 알코올과 반응시켜 AB 디사카라이드를 형성시키기를 원했다. 그후 페닐 술폭시드 C를 활성화하고 AB 디사카라이드와 커플링하여 원하는 트리사카라이드 ABC를 형성하였다.

[트라사카라이드의 일단계 합성]

술폭시드 21, 및 22와 친핵제 23을 예비혼합하고 -78℃에서 에테르-메틸렌 클로라이드의 1:1 혼합물에 용해시켰다. 메틸 프로피올레이트(20 eq), 이어서 촉매량의 트리플릭산(0.05 eq)를 이 용액에 첨가하였다. 반응물을 -70℃에서 반시간 교반한 다음 그것을 포화 나트륨 바이카보네이트 용액에 부어 냉각하였다.

원하는 트리사카라이드 49는 플래쉬 크로마토그래피후에 25% 수율로 분리된 주요 생성물이었다. 반응 혼합물로부터 다른 트리사카라이드가 분리되지 않았다. 분리된 유일한 중요한 커플링 생성물은 디사카라이드 18, 트리사카라이드의 전구체이었다. p-메톡시 페닐 술폭시드 B로서 처음에 활성화된다음 친핵제 A의 유리 C-4 히드록실과 반응시켜 AB 디사카라이드(48)를 형성하는 것을 원한 바와 같이 반응을 연속 방식으로 취하였다. 이어서, 페닐 술폭시드 C를 활성화하고 디사카라이드 AB와 반응시켜 원하는 트리사카라이드 ABC(49)를 형성한다.

제안된 메카니즘과 일치하여, 동일한 반응을 -100℃(헥산-액체질소조)에서 수행할 때, 분리된 생성물은 비활성화 술폭시드 C와 다같이 디사카라이드 AB의 실릴 에테르 (60% 수율)이다. 따라서, 저온에서 실험을 수행하는 것은 반응의 단계적 특성을 확인한다.

일단계 글리코실화의 수율은 바람직하지 못한 크로스 커플링에 의해 한정되는 것이 아니라 글리코실 도너, 특히 활성화제의 부존재에서조차 상온에서 쉽게 분해되는, 케토 술폭시드 C의 불안정성에 의해 한정된다. 실제로, 페닐 술폭시드 21과 유리 알코올 23의 크로스 커플링으로부터 디사카라이드 5% 이하가 비록 21이 과량으로 존재하여도 검출되었고; 21과 22의 크로스 커플링으로부터 디사카라이드가 검출되지 않았다. 피라노스 링에 케톤 작용기의 존재는 이러한 술폭시드의 불안정성에 기여할 수 있다.

글리코실화에 대한 총수율을 증가시키려는 노력에서, 케토 술폭시드의 적절히 보호된 형태의 사용을 조사하였다.

[BC 커플링 수율 개선]

AB 디사카라이드 48 및 친핵제 23이 구조적으로 매우 유사하므로, 친핵제 23을 C 와 글리코실화 반응에서 글리코실 수용체용 모델 화합물로서 선택하였다. 케토 술파이드에 대한 전구체, C-4 적도방향(equatorial) 알코올을 글리코실 도너로서 선택하였다. C-4 중심에서 서로 다른 보호기의 효과를 시험하였다.

글리코실 도너의 적절히 보호된 C-4 알코올의 사용은 글리코실화에 대한 수율을 상당히 증가시켰다(40-60%). 그러나, 시험된 모든 경우에 대해, 바로 다음의 표 2에서 예시된 바와 같이, 아노머 중심에서 입체화학적 조절 손실이 있었다.

[표 2]

C-4에서 보호기의 효과

C 링상의 적절히 보호된 C-4 축방향(axial) 히드록실의 존재를 또한 시험하였다. 이 경우에, 원하는 α입체선택성을 얻었으나; 글리코실화에 이어 추가 두 단계가 필요하였다. 이들은 케톤으로 축방향 알코올의 산화에 이어 C-4 알코올의 탈보호를 포함한다. 이들 추가 단계는 총수율 감소를 초래한다. 따라서, 트리사카라이드의 일단계 합성에 대한 25% 수율이 적당한 듯 하지만, 추가 작용기 처리의 결핍이 합성을 효과적으로 한다.

[아글리콘 ε-피로마이시논으로 트리사카라이드의 커플링]

트리사카라이드는 A 링상에 아노머 페닐 술파이드를 가지고 있다. mCPBA를 사용하여 이 술파이드를 술폭시드로 산화시켰다. 아글리콘 ε-피로마이시논 15(1.0 eq) 및 트리사카라이드 술폭시드 49(3.0 eq)를 에테르-메틸렌 클로라이드 1:1 혼합물에 용해시키고 -78℃로 냉각하였다. 메틸 프로피올레이트(20 eq)를 반응 혼합물에 첨가하고, 이어서 촉매량(0.05 eq)의 트리플릭산을 첨가하였다.

트리플릭산의 첨가후에 곧 취한 TLC는 아글리콘 바로 위에 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 완성 및 크로마토그래피에 의한 정제후에, 이 새로운 화합물이 NMR 스펙트로스코피에 의해 트리사카라이드(54)에 커플링된 아글리콘임을 확인하였다. 아노머 프로톤에 대한 3.0Hz의 JH-H커플링 상수가 글리코시드 결합의 α입체화학과 일치하였다.

[시클라마이신의 탈보호]

시클라마이신 0의 합성을 완료하기 위해 A 및 B 링상의 벤질 에테르 보호기의 제거가 필요하였다. 벤질 에테르를 촉매로서 탄소상 Pd(OH)2를 사용하여 가수소분해에 의해 제거하였다. 불행히도, 이들 반응 조건하에, 벤질 에테르에 더하여, 아글리콘도 분해된다. 돌이켜 볼 때, 슈가가 부착되는 아글리콘의 C-7 히드록실이 벤질 에테르와 비슷하므로 이것은 놀라운 것은 아니었다. 따라서, 순수 시클라마이신 0을 얻기 위하여, 가수소분해 조건이 이용될 수 없었다. 이러한 문제점을 해결하기 위해, 슈가 링 A 및 B상에 보호기를 바꿀 필요가 있었다.

파라 메톡시 벤질 에테르는 2,3-디클로로-5,6-디시아노-1,4-벤조퀴논(DDQ)을 이용하여 온화한 산하 조건하에 쉽게 분해될 수 있다(참조예, Ikemoto and Schreber J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9657; Horita et al. Tetrahedron. 1986. 42, 3021; Oikawa et al. Tet. Lett. 1984. 25, 5393; 및 Carbohydrates. Ed. Collins, P. M. Champman and Hall; New York, 1987). 따라서, 마르셀로마이신(아글리콘의 C-7 위치에 트라사카라이드를 생성함) 및 A 링(C 3에서 p-메톡시 벤질 에테르 보호기가 있음)의 1:1 혼합물을 과량의 DDQ로서 처리하였다. 이들 반응 조건하에 단지 A 링상의 p-메톡시 벤질 에테르가 가수분해되며 반면에 마르셀로마이신은 손상되지 않고 그대로 있었다. 이러한 결과를 기초로, 시클라마이신 트리사카라이드상의 보호기를 바람직하게도 벤질에서 p-메톡시 벤질 에테르로 바꿀 수 있다.

[PMP 파라-메톡시벤질]

모노사카라이드 21, 22a 및 23a를 통상의 과정에 따라 일단계(20% 수율)로 원하는 시클라마이신 트라사카라이드를 합성하는데 사용할 수 있다. 트리사카라이드 술파이드를 mCPBA로서 술폭시드로 산화시킨 다음 촉매 트리플릭산 글리코실화법을 이용하여 아글리콘으로 커플링하였다.

커플링된 생성물 54a의 탈보호는 파라-메톡시 벤질 에테르의 제거를 필요로 하였다. 커플링된 생성물 54a(1 mg)을 CH2Cl2에서 DDQ로서 처리하고 상온에서 10시간 교반하였다. 반응을 깨끗하게 진행시켜 시클라마이신 0을 정량적으로 제공하였다.

[제어된 중합을 통해 올리고사카라이드의 급속 합성: 2-데옥시 푸코스 호모폴리머의 억제된 라이브러리]

시클라마이신 트리사카라이드의 일단계 합성에 사용된 2-데옥시 푸코스 술폭시드 B는 이작용성 슈가이다. 그것은 아노머 중심에 이탈기(p-메톡시 페닐 술폭시드)를 함유하며 글리코실 도너로서 작용할 수 있다. 이에 더하여, 그것은 C-4 중심에 실릴 에테르를 가지고 있으며 또한 글리코실 수용체로서 작용할 수 있다.

생활성 천연 제품에서 발견된 가장 통상적인 2-데옥시 슈가는 2,6-디데옥시 슈가이다. 그들은 자주 아글리콘에 결합된 다이머 또는 트리머로서 발생된다. 일단계로 복잡한 트리사카라이드의 합성으로서 본 발명자이 성공이 주어진다면, 제어된 중합을 통해 올리고사카라이드의 급속 집합체에 대해 이러한 개념을 확장할 수 있을까 의심스러웠다. 이작용성 2,6-디데옥시 B 링은 단일 반응에서 호모폴리머를 합성하는 가능성을 조사하는 기회를 제시하였다.

술폭시드 22(2.0 eq) 및 친핵제 55(1.0 eq)를 에테르-메틸렌 클로라이드 1:1 혼합물에서 예비혼합하고 -78℃로 냉각하였다. 반응 혼합물을 염기(2.0 eq)와 무수 트리플릭산(1.0 eq)으로서 처리하였다(참조, 위). 그 후 곧 취한 반응의 TLC는 생성물에 관한 두개의 새로운 스폿의 존재를 나타냈다. 크로마토그래피후에 두가지 생성물을 분리하고 NMR 스펙트로스코피에 의해 특성화하였다. 이들 생성물은 AB 디사카라이드 56(45% 수율) 및 ABB 트리사카라이드 57(20% 수율)이었다. 아노머 프로톤에 대한 JH-H커플링 상수는 모든 글리코시드 결합에 대한 α입체 화학과 일치하였다. 이 결과는 2-데옥시 푸코스의 호모폴리머가 일단계로 입체선택적으로 형성될 수 있다는 것을 제시하였다.

2-데옥시 푸코스의 보다 높은 차수의 폴리머를 얻을 수 있는 지를 측정하기 위하여, 글리코실화에 사용된 술폭시드 B(22)의 당량수를 증가시켰다.

B 5.0 당량 및 A 1.0 당량을 사용하였을 때, 디, 트리, 테트라, 펜타 및 헥사사카라이드의 랜덤 혼합물이 상기에 제시된 바와 같이, 단일 반응으로 얻어졌다. 따라서, 술폭시드법을 이용하여 제어된 중합을 통해 2-데옥시 푸코스의 호모폴리머 혼합물을 신속하게 합성할 수 있다.

술폭시드 글리코실화법은 강력하고 가전성(versatile)이 있다. 단일 반응에서 성분 모노사카라이드로부터 시클라이신과 같은 복잡한 트리사카라이드를 신속하게 합성하는데 그것을 사용할 수 있다. 이러한 전략은 일단계로 성분 디사카라이드로부터 헥사사카라이드를 합성하는데 확장될 수 있었다. 이에 더하여, 이작용성 슈가를 이용함으로서 술폭시드법으로서 단일 단계로 호모폴리머(사슬 길이 변화)의 혼합물을 합성할 수 있다. 지금까지, 본 발명자들은 단지 제어된 중합 반응을 위한 기질로서 2-데옥시 푸코스를 시험하였다. 그럼에도 불구하고, 이러한 전략은 원칙적으로 그외에 다른 이작용성 기질을 포함하도록 확장될 수 있었다.

일단계 및 제어된 중합 전략의 조합을 이용함으로서 상기에 제시된 바와 같이, 여러가지 아글리콘이 결합된 올리고사카라이드의 라이브러리를 매우 신속하게 합성할 수 있다. 이들 올리고사카라이드 라이브러리는 예를들어 DNA 친화성 크로마토그래피를 이용하여, DNA 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 이러한 연구는 DNA 결합을 주는 올리고사카라이드에서 특징을 명백히하는데 도움이 될 것이다.

술폭시드 글리코실화법은 종래의 방법을 이용하여 올리고사카라이드의 구성에 신속하고, 유연하며 효과적이다. 글리코실 도너의 반응성은 페닐 링의 파라 위치에 치환체를 변화시켜 조절될 수 있다. 전자-공여 치환체는 미치환 경우에 비해 반응 속도를 가속시키며, 반면에 전자 제거기는 반응 속도를 감속시킨다. 글리코실 수용체의 반응성도 조절될 수 있다. 실릴 에테르는 유리 알코올 보다 글리코실화에서 느리게 반응한다. 이것은 단일 반응에서 두가지 또는 그 이상의 글리코시드 결합의 제어된 형성을 허용한다. 이러한 전략이 단일 단계로 성분 모노사카라이드로부터 입체선택적으로 시클라마이신 0 트리사카라이드를 합성하는데 이용되었다. 또한, 이작용성 슈가가 올리고사카라이드의 라이브러리를 합성하는데 사용될 수 있다. 따라서 술폭시드법은 제어된 올리고화를 통해 올리고사카라이드의 급속 합성을 하게 하는 가전성 글리코실화법이다.

[고상에서 글리코시드 결합의 형성]

강력한 글리코실 수용체를 글리코시드 결합에 해가 되지 않는 조건을 이용하여 합성 종료시에 쉽게 분해될 수 있는 결합을 통해 불용성 지지체(이후 수지로 칭함)에 결합시킨다. 수지는 유기 용매에서 팽창되고 글리코실 수용체를 결합하기 위한 위치를 가진 불용성 폴리머일 수 있다. 바람직한 수지는 폴리스티렌 수지, 이를테면 Merrifield 수지, 및 PEG-유도체화 폴리스티렌 수지, 이를테면 TentaGell 수지를 포함하나 이에 국한하지 않는다.

결합 형태는 폴리머 상 및 글리코실 수용체에 이용될 수 있는 작용성 위치의 형태에 따른다. 폴리스티렌-기재 수지가 클로로메틸 치환체로서 쉽게 작용화될 수 있으므로, 결합은 전형적으로 글리코실 수용체에 유리 히드록실로서 수지에 벤질 클로라이드의 친핵성 치환에 의해 형성된, 벤질 에테르이다. 별도로, 글리코실 수용체 위 산의 염으로서 수지 위 벤질 클로라이드의 친핵성 치환에 의해 형성되는 벤질 에스테르가 사용될 수 있다(제4도). 결합의 두가지 형태 모두는 수지를 Hg(Ⅱ) 화합물로서 처리함으로서 글리코실 수용체의 아노머 탄소에서 쉽게 가수분해될 수 있다. 별도로, 에스테르 결합이 펩티드 합성에서 수지로 에스테르 결합에 대해 수행된 것처럼 가메탄올분해에 의해 가수분해될 수 있다. Hg(Ⅱ)법은 수지의 부분표본을 처리하여 반응범위를 검측하는데 바람직하다. Hg(Ⅱ)법은 또한 완료된 올리고사카라이드가 최종 생성물로서 원할 때 바람직하다. 가메탄올분해법은 완료된 올리고사카라이드가 최종 생성물로서 원할 때 바람직하다(제4도).

강력한 글리코실 수용체는 그것이 또한 수지에 결합을 위한 적합한 위치를 가지고 있다는 조건하에, 강력한 반응성 히드록실, 아민, 및/또는 티올을 비롯하여, 한가지 또는 그 이상의 강력한 반응성 친핵제를 가진 분자일 수 있다. 강력한 반응성 친핵제는 유리 친핵제 또는 일단 글리코실 수용체가 수지에 결합되면 쉽게 제거될 수 있는 임시 보호기를 가진 친핵제이다. 강력한 글리코실 수용체는 또한 영구적으로 보호된 친핵제를 가질 수 있으며, 친핵제는 임시 보호기를 제거하는데 사용되는 조건하에 탈보호될 수 없는 친핵제이다. 강력한 글리코실 수용체는 슈가 또는 스테로이드, 아미노산 또는 펩티드, 극성 리피드, 폴리시클릭 방향족 화합물, 등을 포함하나 이에 국한하지 않는, 다른 친핵제-생성 분자일 수 있다. 어떤 위치에서 선택적 보호 및 탈보호를 허용하는 슈가에 대한 보호기 반응식이 잘 알려져 있다(참조예, Binkley, 상기).

수지 결합에 따라, 강력한 반응성 친핵제를 필요하다면 선택적으로 탈보호시키며, 유도체화 수지(derivatezed resin)를 밤새 동결건조시키고 사용시까지 데시케이터에 저장한다. 그후 수지를 특수하게 디자인된 유리 프릿이 있는 반응관에 넣는 것이 바람직하다. 개구부를 예를들어 고무 격벽으로 밀봉한다(참조예, 제5도). 일반적인 장치에 많은 변형이었을 수 있다. 그러나, 중요한 특징은 다음과 같이 열거될 수 있다:

a) 반응실로 용매 및 용해된 시약의 첨가를 위한 그리고 무수 분위기를 유지하는데 적합한 입구; (제시된 장치에서, 컵형 개구부위의 고부 격벽은 외부 공기로 반응실의 노출을 방지하면서 캐뉼라 또는 시런지 니들에 의해 용매 및 용해된 시약을 첨가한다. 반응관의 바람직한 일예에서, 이 입구는 또한 불활성 가스, 이를테면 질소 또는 아르곤을 방출하기 위한 벤트로서 입구를 겹치게 하여 장치내에 과도한 압력의 빌드 업을 방지하는 T-커넥터 또는 유사 어댑터를 구비하고 있다.)

b) 미결합 성분, 그러나 수지외에, 이를테면 미반응 용해 시약을 반응실에서 세척할 수 있는 거칠기(coarseness) 또는 다공성이 있는 프릿 또는 필터를 구비한 수지 및 시약 용액을 홀딩하기 위한 반응식:

c) 불활성 가스의 도입을 위한, 입구측에 반대인 프릿측에 위치한, 포트; 가스는 프릿을 통과하며, 따라서 반응 혼합물을 교반하고, 반응 혼합물 위에 정착하고, 따라서 반응실내에 무수 분위기를 유지한다(제5도로부터 명백하듯이, 아르곤 또는 질소는 프릿을 통한 용매의 흐름과 반대인, 아래에서 수지를 통과하고 수지를 동시에 교반한다. 바람직한 일예에서, 이 포트는 진공하에 용매의 제거를 위한 아스피레이터로 포트를 부착되게 하는 T-커넥터 또는 유사 어댑터를 구비하고 있다.)

장치의 형태는 반응실 대부분의 수준까지 장치가 냉각조에 함침될 수 있는 형태인 것에 주목해야 한다. 따라서, 프릿 아래에, 장치는 제5도에 제시된 바와 같이, U-형일 수 있으며, 그 결과 가스 포트가 냉각 매질위에 위치할 수 있다.

다음에, 불화성 가스, 이를테면 아르곤 또는 질소, 바람직하게는 아르곤이 약 1 시간 동안 수지를 통과한다. 그후 수지를 톨루엔, 에테르, TIIF, 메틸렌 클로라이드, 클로로포름, 프로피오니트릴, 또는 그의 혼합물을 포함하나 이에 국한하지 않는 무수 용매 3-5 ml에 분산시킨다. 이전 단락의 논의에서, 용매 선택이 인접 기 참여가 포함되지 않는 반응에 대한 글리코실화의 입체화학 성과에 영향이 있을 것이라고 이해된다. 아르곤 플로우를 조절하여 수지를 부드럽게 교반하고 용매가 프릿을 통해 유출하는 것을 방지한다.

그후 글리코실 술폭시드를 무수 조건하에 무수 용매 2-4 ml에 용해시키고 캐뉼라에 의해 수지를 함유한 반응관에 전이시킨다. 글리코실 술폭시드는 또한 분자내 어떤 곳에 존재한 보호기를 가질 수 있다. 사카라이드 사슬이 더욱 확장될 것이라면, 글리코실 술폭시드도 적어도 한가지 임시 보호기를 가지고 있어야 한다. 전형적으로 글리코실 술폭시드를 수지위 글리코실 수용체의 양에 비해 2-4배 과량으로 첨가한다.

글리코실화 반응을 개시하는데 사용된 활성화법에 따라, 비친핵성 염기, 이를테면 2,6-디-t-부틸-4-메틸 피리딘 또는 Hunig 염기(디이소프로필 에틸아민)을 글리코실 술폭시드와 함께 용해시키거나 수지를 함유한 반응관에 첨가할 수 있다. 사용될 때, 염기가 첨가된 글리코실 술폭시드의 양에 비해 약간 과량으로 존재하는 것이 바람직하다.

그후 수지를 함유한 반응관을 -78℃에서 냉각조에 함침시킨다. 반응을 위한 글리코실 도너를 활성화시키기 위하여, 큰 부피의 무수 용매에 희석된 트리플릭산 0.05 당량(즉, 촉매) 또는 무수 트리플릭산 0.5 당량을 무수 조건하에 반응 혼합물에 첨가한다. 몰 당량을 사용된 글리코실 술폭시드의 양에 대해 측정한다. 또한, 큰 부피 희석은 순수 활성화제의 부피를 용매의 적당한 부피의 첨가에 의해 적어도 100배 희석하는 것을 의미한다(예, 순수 활성화제 1μL를 도너에 첨가전에 용매 적어도 90μL에 첨가한다).

활성화제의 첨가는 예를들어, 캐뉼라의 도움으로서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에 적합한 다른 활성화제는 알킬- 또는 아릴실릴 트리플레이트(예, 트리메틸실릴 트리플레이트), 알킬- 또는 아릴술페닐 트리플레이트, 및 알킬- 또는 아릴셀렌닐 트리플레이트를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 프로톤이 반응에서 생성된다면(무수 트리플릭산 0.5 당량이 술폭시드를 활성화하는데 사용될 때처럼), 산 스캐빈저가 수지 혼합물에 존재해야 한다. 더구나, 활성화제가 촉매량(예, 글리코실 술폭시드에 대해 ＜0.1 당량)으로 사용되지 않는다면, 활성화제를 첨가전에 약 100-배 또는 그 이상 희석해야 한다. 무수 트리플릭산으로서 희석이 한정적이며, 따라서 수지위 글리코실 수용체의 트리플레이션어 회피된다고 발견된 바 있다.

다음에, 수지를 아르곤 플로우에 의해 부드럽게 교반한다. 전형적으로 수지를 반복적으로 린스하여 부산물과 미반응 글리코실 도너를 제거한후 약 30분간 반응을 계속한다. 원한다면, 수지의 부분표본을 제거하고, 수지를 린스하여 시약을 제거한다음, 결합을 수지로 가수분해함으로서 반응을 검측할 수 있다. 별도로, 글리코실 수용체가 아노머 탄소에 연결된 술파이드 유도체에 의해 수지에 결합되는 슈가라면, 아노머 탄소에 링크를 Hg(Ⅱ) 화합물로서 가수분해할 수 있다. Hg(Ⅱ)에 의한 가수분해는 글리코실화 반응의 범위를 검측하는데 바람직하다. 생성물과 반응의 진행을 비교를 위해 표준물질을 사용한 박층 크로마토그래피에 의해 분석할 수 있다. 예를들어, 반응 혼합물로부터 부분표본의 Hg(Ⅱ) 가수분해후에, 가용성 생성물을 TLC에 의해 분석한다. 수지에 결합된 모노사카라이드 잔기의 부존재를 반응이 완료되었다는 표시로서 취한다.

생성물을 얻기 위하여, 전형적으로 수지를 메틸렌 클로라이드 이어서 메탄올(바람직하게는, 약 10 사이클)로서 반복하여 린스한다. 필요하다면 커플링을 반복하여 반응을 완료시킨다. 달리, 사카라이드 사슬이 추가로 확장될 것이라면, 다음에 임시 보호기를 제거하고, 수지를 반복적으로 린스하여 시약을 제거하고, 다른 글리코실 술폭시드 잔기를 이전과 같이 첨가한다.

합성 완료 및 린스하여 시약을 제거할 때, 디사카라이드, 올리고사카라이드 또는 글리코콘주게이트를 수지로부터 제거한다. 그후 필요하다면 생성물을 정제하고 및/또는 탈보호할 수 있다. 별도로, 디사카라이드, 올리고사카라이드 또는 글리코콘주게이트를 스크리닝 과정에서 수지에 더욱 결합되는 동안 사용하여 생물학적 활성을 명백히 할 수 있다.

전략적으로, 올리고사카라이드의 혼합물을 또한 고상 합성에 의해 제조하고 생물학적 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 혼합물을 제조하기 위하여, 한가지 이상의 서로 다른 형태의 글리코실 술폭시드를 합성의 1회 또는 그 이상의 사이클에서 수지에 첨가한다. 합성에서 단지 한 위치에 슈가를 변화시켜 그 위치에서 구조 조건을 시험하는 것이 바람직할 수 있다. 이 방법에서, 구조-활성 관계를 특정 탄수화물 및 그의 수용체 두가지 모두를 알고 있는 경우에 신속히 평가할 수 있다. 별도로, 합성에서 여러 위치에 슈가를 변화시키고, 여러가지 수용체에 대한 결합을 위해 스크리닝될 수 있는 착물 혼합물을 제조하는 것이 바람직할 수 있다. 각 경우에, 활성이 검측된다면, 고상 합성에 의해 생성된 혼합물로부터 활성 펩티드를 확인하기 위해 펩티드에 사용된 것과 유사한 방법을 사용하여 활성 화합물을 확인할 수 있다(참조예, Furka et al. Int. J. Peptide Protein Res. 1992, 37, 487; Lam et al. Nature 1991, 354, 82; Houghter, R. A. Nature 1991, 354, 84; Zuckermann et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 4505; Petithory Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88, 11510; Geyse et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, 81, 3998; Houghten Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, 82, 5131; Fodor et al. Science 1991, 251, 767).

[실시예]

다음의 특정 실시예는 본 발명을 실시하는 여러가지 일예로 독자에게 보다 좋은 도움을 제공한다. 이들 특정 실시예는 단지 예시적이므로, 다음 기술에서 어느 것도 본 발명을 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 이러한 제한은 물론 첨부 청구범위에 의해서만 한정된다.

[A 단일 단계로 시클라마이신 0 트리사카라이드의 합성]

제1도에서는 특정 트리사카라이드, 시클라마이신 0 트리사카라이드를 성분 모노사카라이드로부터 단일 단계에서 보호 형태로 입체선택적으로 합성하는 용액에서 복수 글리코시드 결합을 형성하는 방법에 대한 일예를 도시한다. 모노사카라이드 1, 2, 및 3을 제시된 바와 같이(각각 417mg, 1.812mmol; 541mg, 1.2mmol; 및 165mg, 0.604mmol), 3:3:1의 비율로 결합한다. 그후 혼합물로부터 무수 톨루엔에서 공비 혼합물의 종류에 의해 물을 제거한다(이 건조 단계는 톨루엔(약 30 mL)에 슈가 혼합물을 용해시키고 진공하에 회전 증발기에서 톨루엔을 제거함으로서 수행된다. 그후 무수 슈가 혼합물을 바로 사용하거나 필요할 때까지 불활성 가스하에 저장한다.)

다음에 무수 슈가 혼합물을 50 mL 짜리 불꽃 건조된 플라스크에서 무수 메틸렌 클로라이드 20 mL에 용해시킨다. 그후, 메틸 프로피올레이트 20 당량을 함유한 새로 증류된 디에틸 에테르 20 mL를 첨가한다(반응에서 생성되는 술폰산을 포획하는데 프리피올레이트 에스테르를 사용한다). 그후 용액을 -78℃로 냉각한다. 촉매량의 트리플릭산(5.3μL, 0.05 eq.)을 적가하고, 반응물을 45분간에 걸쳐 -78℃ 내지 -70℃로 가열한 다음 포화 NAHCO3로서 냉각한다. 2상 혼합물을 CH2Cl2(3 x 15 mL)로서 추출한다. 유기 추출물을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고 농축한다. 주요 생성물, 트리사카라이드 5를 에틸 아세테이트로서 추출과 실리카 겔에서 플래쉬 크로마토그래피(20% 에틸 아세테이트/석유 에테르)후에, 모노사카라이드 3에 기초하여, 25% 수율로 분리한다.

트리사카라이드 5의1H NMR 스펙트럼을 제12 및 13도에 제시한다. 성취된 입체선택성은 도너-수용체 쌍 및 글리코실화 조건(용매, 온도)의 작용이다. 본 발명자들은 촉매 트리플릭산이 -30℃ 이하에서 확인가능한 속도에서 글리코시드 결합을 아노머화하지 않는다는 것을 발견하였다. 다른 트리사카라이드가 생성되지 않는다. 실제, 반응에서 검출된 유일한 다른 중요 커플링 생성물은 디사카라이드 4 (제1도의 반응식 1, 15% 수율;1H NMR, 제14도), 트리사카라이드 5에 대한 전구체이다. 페닐 술폭시드 1과 유리 알코올 3의 크로스 커플링으로부터 디사카라이드 5% 이하가 1이 과량으로 존재한다해도 검측되며; 1 및 2의 크로스 커플링으로부터 디사카라이드가 검측되지 않는다.

따라서, 반응에서 트리사카라이드 5의 수율은 바람직하지 않은 크로스 커플링에 의해 한정되지 않는다. 그러나, 활성화제의 부존재하에서 조차 상온에서 쉽게 분해되는, 글리코실 도너, 특히 케토 술폭시드 1의 불안정성이 수율에 영향이 있을 수 있다.

반응 생성물은 p-메톡시 페닐 술폭시드 2가 페닐 술폭시드 1보다 빠르게 활성화하고, C-4 알코올 3이 C-4 실릴 에테르 2 보다 빠르게 반응하면서, 글리코실화가 연속 방식으로 일어난다는 것을 나타낸다. 이 시퀀스와 일치하여, 반응을 -100℃에 냉각한다면, 단지 디사카라이드 4의 실릴 에테르가 분리될 수 있다(60%).

따라서, 상기에 기재된 일단계 반응의 생성물은 본 발명에 의해 성취된 원리; 즉 글리코실 도너와 글리코실 수용체 두가지 다의 반응성이 효과적으로 조절되어 글리코실화가 연속 방식으로 일어나서 단일 단계로 원하는 올리고사카라이드를 생성한다는 것을 예시한다.

끝으로, 일단계 반응에서 생성된 트리사카라이드(5)가 A 링위의 아노머 페닐 술파이드를 가진다는 사실에 주목해야 한다. 글리코실화를 위해 아노머 페닐 술폭시드를 활성화하는 조건에 대해 아노머 페닐 술파이드가 안정하나(“disarmed”), 그들은 온화한 조건하에 쉽게 산화될 수 있다(참조, Mootoo et al. J. Am. Chem. Soc. 1988, 110, 5583; Veeneman and van Boom Tet. Lett. 1990, 31, 275; 및 Mehta and Pinto Tet. Lett. 1991, 32, 4435). 따라서, 술폭시드 글리코실화 반응은 또한 올리코사카라이드 합성을 위한 반복적 전략에 잘 쓰인다(참조, Fresen and Danisherfsky J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6656; Halcomb and Danishefsky J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 6661; Mootoo et al. supra; Veeneman and van Boom. supra; 및 Mehta and Pinto, supra; Nicolaou et al. J. Am. Chem. Soc. 1984, 106, 4189; Mootoo et al. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 8540; Barrett et al. J. Am. Chem. Soc., 1989, 111, 1392). 시클라마이신 트리사카라이드 5를 80% 수율로 상응하는 술폭시드로 산화시키고(1.2 eq. mCPBA, CH2Cl2-78℃ 내지 -50℃, 2 hr) 시클라마이신 크로모포르로 커플링을 준비한다.

모노사카라이드 1을 L-람노스로부터 총수율 60% 로 제조한다(1H NMR; 제9도)(참조, Martin et al. Carbohydr. Res. 1983, 115, 21). 모노사카라이드 2(1H NMR; 제10도) 및 3(1H NMR; 제11도)을 L-푸코스로부터 전체 수율 각각 47% 및 52%로 제조한다(참조, Giese et al. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 1987, 26, 233).

본 발명의 다른 방법에 따라, 각 출발물질의 제조, 관심있는 트리사카라이드를 형성하는 그들의 오케스트라화(orchestrated) 축합, 및 아글리콘으로 그들의 후속 커플링을 다음에 상세히 기술한다.

[페닐-3-O-벤조일-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈락토피라노시드(31a)]

화합물 37(1.41g, 5.9mmol)을 디클로로메탄에 용해시키고 아르곤하에 -78℃로 냉각한다. 나트륨 하이드라이드(566mg, 23.6mmol)을 이 용액에 첨가한다. 활기찬 비등이 존재한다. 10 분후에, 벤조일 클로라이드(2.05mL, 17.7mmol)을 용액에 첨가한다. 반응물을 -78℃에서 1/2 시간 교반하고, 점차 -60℃로 가열한 다음 NaHCO3의 포화 용액에 부어 냉각시킨다. 얻어진 용액을 CH2Cl2(3 x 50 mL)로서 추출하고; 유기층을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시킨 다음 진공하에 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 고체(1.6g, 70%)로서 생성물을 얻는다. Rf=0.3(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-3,4-O-벤조일-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈락토피라노시드(32a)]

이 화합물을 다음 두 단계의 시퀀스로 페닐-3,4-O-디아세틸-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈락토피라노시드 36으로부터 합성한다: (i) NaOMe/CH3OH, 암버라이트 IR(120) 플러스 이온-교환 수지; 및 (ii) 벤조일 클로라이드, 피리딘, Rf(TLC)=0.3(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-3,4-O-벤조일-2,6-디데옥시-1-술피닐-α-L-갈락토피라노시드(32)]

술파이드 32a(900mg, 1.99mmol)를 디클로로메탄에 용해시키고 아르곤하에 -78℃로 냉각한다(아세톤/건조-얼음조). mCPBA(483mg, 2.80mmol)을 첨가하고 반응물을 -78℃에서 1시간 교반한다. 반응물을 점차 두시간에 걸쳐 0℃로 가열한 다음 NaHCO3의 포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 2상 혼합물을 CH2Cl2(3 x 25 mL)로서 추출한다. 유기층을 결합하고, 염수로 세척한다음 무수 Na2SO4에서 건조시킨다. 플래쉬 크로마토그래피(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 결정 고체(690mg, 80% 수율)로서 술폭시드 32를 제공한다. Rf(TLC)=0.4(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[3,4-O-벤조일-2,6-디데옥시-갈락토피라노실-α-(1→4)-페닐-3-O-벤조일-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈락토피라노시드(33)]

술폭시드 32(177mg, 0.4mmol), 친핵제 31a(80mg, 0.2mmol), 실릴 에테르 31b(93mg, 0.2mmol) 및 염기(82mg, 0.4mmol)을 에비혼합하고 톨루엔으로서 3회 공비혼합한다. 아르곤하에 25 mL 짜리 불꽃-건조된 플라스크에 새로 증류된 CH2Cl2를 첨가한다. 공비혼합된 반응체를 CH2Cl210 mL에 용해시키고 플라스크에 첨가한 다음, -78℃로 냉각한다. 10분후에 무수 트리플릭산(33.6μL, 0.2mmol)을 첨가한다. 반응에 TLC(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르)가 이어진다. TLC는 친핵제 31a가 완전히 반응하며 반면에 실릴 에테르 31b가 미반응하여 남아있다는 것을 나타낸다. 반응물을 점차 2시간에 걸쳐 -60℃로 가열한다음 NaHCO3의 포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 CH2Cl2(3 x 15 mL)로서 추출하고, 무수 Na2SO4에서 건조시킨 다음 진공하에 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 결정 고체(85mg, 60% 수율)로서 디사카라이드 33을 제공한다. Rf=0.4(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[A 링의 합성]

A 링의 합성은 L-푸코스로서 출발하고, 다음 반응식에 따라, 전체 수율 60%로서 6 단계로 성취된다.

[1,3,4-O-트리-O-아세틸-2,6-디데옥시-α-L-갈락토피라노시드(35)]

빙초산 10 mL내 테트라-O-아세틸-푸코스(5.0g, 15.05mmol)의 용액에 적가 방식으로 히드로브롬산 15 mL(30%)을 첨가하고 얻어진 용액을 상온에서 교반한다. 2시간후에 반응이 완료된다. 반응 혼합물을 탄소 200 mL에 분산된 무수 나트륨 카보네이트(Na2CO3) 25g을 함유한 플라스크로 부어 무수 조건하에 완성시킨다. 얻어진 혼합물을 상온에서 45분간 교반하고 여과시킨다. 방법을 여과액으로서 반복한다. 그후 얻어진 용액을 진공하에 농축하여 원 브로마이드 34(5.2g, 80%)를 얻는다. 이것을 다음 단계에 추가 정제 없이 사용한다.

환류 콘덴서 및 첨가 깔때기가 구비된, 2 리터 삼복 플라스크에 새로 증류된 벤젠 1 리터를 첨가한다. 푸코스 브로마이드 34(52g, 12.17mmol)를 벤젠(15 mL)에 용해시키고 플라스크에 첨가한다. 얻어진 혼합물을 환류 가열한다. AIBN(200mg, 1.21mmol)을 이 용액에 첨가한다. 30분후에 벤젠(100 mL)내 트리부틸 틴 하이드라이드(4.91 mL, 18.25mmol)을 반응 혼합물에 첨가 깔때기에 의해 16 시간에 걸쳐 적가한다. 이 시간의 종료시에, 그후 반응 혼합물을 상온으로 냉각하고 진공하에 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 결정 고체로서 생성물 35(2.5g, 81%)를 제공한다. Rf(TLC)=0.3(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-3,4-O-디아세틸-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈락토피라노스(36)]

화합물 35(2.5g, 9.11mmol) 및 티오페놀(1.12 mL, 10.94 mmol)을 디클로로메탄(100 mL)에 용해시키고 아르곤하에 -78℃로 냉각한다. Et2OㆍBF3(5.6 mL, 45.5 mmol)을 시린지에 의해 용액에 적가한다. 반응을 저온에서 1시간 유지시킨 다음 점자 0℃로 가열하고 그것을 포화 NaHCO3수용액에 부어 냉각한다. 얻어진 2상 혼합물을 CH2Cl2(3 x 50 mL)로서 추출하고; 유기층을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고 농축한다. 원 물질의 플래쉬 크로마토그래피(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 고체(2.1g, 71% 수율)로서 술파이드 36을 제공한다. Rf(TLC) 0.3(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈락토피라노시드(37)]

화합물 36(2.1g, 6.48mmol) 및 메탄올(50 mL)에 용해시키고 나트륨 메톡시드(420 mg, 7.78 mmol)을 용액에 첨가한다. 반응물을 상온에서 1시간 교반한다. 이 시간의 종료시에 취한 TLC(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 반응이 완료된다는 것을 나타낸다. 요액을 암버라이트 IR(120) 플러스 이온교환 수지(1.0g)로서 중화한다. 용액을 프릿 깔때기로 여과시키고, 에틸 아세테이트로서 세척한 다음 농축하여 디올 37을 제공한다. 이 혼합물을 다음 단계에서 축사 정제 없이 사용한다.

[페닐-3-O-벤질-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈락토피라노시드(23)]

벤젠(60 mL)내 37(923mg, 3.84mmol) 및 디부틸 틴 옥사이드(956mg, 3.84 mmol)의 용액을 딘-스타크 장치가 있는 플라스크에서 완류 가열한다. 15시간 후에 반응 혼합물을 상온으로 냉각하고 테트라부틸 암모늄 브로마이드(1.24 g, 3.84 mmol)를 첨가하고 이어서 벤질 브로마이드(5 mL, 8.4 mmol)를 첨가한다. 얻어진 혼합물을 2시간 동안 추가로 환류시킨다음 상온으로 냉각하고 진공하에 농축한다. 원 생성물에 대한 플래쉬 크로마토그래피(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 고체(1.10g, 90% 수율)로서 술파이드 23을 제공한다. Rf(TLC)=0.5(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[B 링의 합성]

B 링의 합성을 다음과 같이 성취한다:

[4-메톡시페닐-3,4-O-디아세틸-2,6-디데옥시-1-티오-L-갈락토피라노시드(38)]

증류된 디클로로메탄(100 mL)내 35(1.95 g, 7.14 mmol)의 용액에 4-메톡시 티오페놀(1 mL, 8.56 mmol)을 첨가하고 얻어진 혼합물을 -78℃로 냉각한다. 여기에 Et2OㆍBF3(4.4 mL, 35.70 mmol)을 적가한다. 반응 혼합물을 저온에서 1/2시간 교반한 다음 점차 -30℃로 가열하고 NaHCO3의 포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 CH2Cl2(3 x 30 mL)로서 추출한다. 유기 추출물을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고, 여과한 다음 진공하에 농축한다. 원 생성물을 플래쉬 크로마토그래피(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르)에 의해 정제하여 술파이드 38(2.12g, 85%)을 제공한다. Rf(TLC)=0.4(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[4-메톡시페닐-2,6-디데옥시-1-티오-L-갈락토피라노시드(39)]

메탄올(100 mL)내 38(1.0 g, 2.82 mmol)의 용액에 나트륨 메톡시드(183 mg, 3.38 mmol)를 첨가한다. 반응 혼합물을 상온에서 2시간 교반한 다음 암버라이트 수지(1.0g)을 첨가하여 중화시킨다. 반응 혼합물을 여과하고 진공하에 농축하여 디올 39(760 mg, 100%)를 제공한다. 이것을 다음 단계에 추가 정제 없이 사용한다. Rf(TLC)=0.1(50% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[4-메톡시페닐-3-O-벤질-2,6-디데옥시-1-티오-L-갈락토피라노시드(40)]

벤젠(200 mL)내 39(2.13 g, 7.90 mmol) 및 디부틸 틴 옥사이드(1.96g, 7.90 mmol)의 용액에 딘-스타크 장치가 있는 플라스크에 환류 가열한다. 15시간후에 반응 혼합물을 상온으로 냉각하고 거기에 테트라부틸 암모늄 브로마이드(2.54 g, 7.90 mmol)를 첨가하고 이어서 벤질 브로마이드(2.82 mL, 23.7 mmol)를 첨가한다. 얻어진 혼합물을 2시간 동안 추가 환류시킨 다음, 상온으로 냉각하고 진공하에 농축한다. 원 생성물에 대한 플래쉬 크로마토그래피(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 오일(2.5g, 88%)로서 술파이드 40을 제공한다. Rf(TLC)=0.25(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[4-메톡시페닐-3-O-벤질-2,6-디데옥시-1-티오-4-O-(트리메틸실릴)-L-갈락토피라노시드(41)]

디클로로메탄(100 mL)내 40(1.4 g, 3.88 mmol) 및 트리에틸아민(1.62 mL, 11.64 mmol)의 용액을 아르곤하에 -78℃로 냉각한다. 이 용액에 TMSOTf(825 μl, 4.27 mmol)를 적가한다. 반응물을 저온에서 30분간 교반한 다음 그것을 NaHCO3포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 CH2Cl2(3 x 30 mL)로서 추출한다. 유기 추출물을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(10% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 오일로서 생성물 41(1.3g, 83%)을 제공하였다.

[4-메톡시페닐-3-O-벤질-2,6-디데옥시-1-술핀일-4-O-(트리메틸실릴)-L-갈락토피라노시드(22)]

디클로로메탄(60 mL)내 술파이드 41(402 mg, 0.93 mmol)의 용액에 과량의 고체 나트륨 바아카보네이트(1.0 g)을 첨가하고 얻어진 혼합물을 -78℃로 냉각한다. 이 분산액에 mCPBA(193 mg, 1.11 mmol)를 첨가하고 얻어진 혼합물을 저온에서 30분간 교반한다. 반응 혼합물의 온도를 점차 1시간에 걸쳐 0℃로 상승시킨 다음 NaHCO3의 포화 용액으로 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 CH2Cl2(3 x 30 mL)로서 추출하고 유기층을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시킨 다음 진공하에 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 고체로서 술폭시드 22(400 mg, 96%)를 제공한다. Rf(TLC)=0.4(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[C 링의 합성]

C 링을 다음과 같이 제조한다:

[메틸-4-O-아세틸-2,3,6-트리데옥시-L-에리트로-헥소피라노시드(44)]

벤젠내 메틸-4-O-아세틸-2,3,6-트리데옥시-L-에리트로-헥스-2-엔오피라노시드 43(2.0 g, 0.01 mmol)(참조, Martin et al. Carbohdr. Res. 1983, 115, 21)의 용액에 촉매 Pd(OH)2/C(200 mg)를 첨가하고 얻어진 분산액을 파르 쉐이커에서 H2(50 psi)하에 교반한다. 2시간후에 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과시키고 진공하에 농축하여 44(2.0 g, 100% 수율)를 제공한다. 이것을 다음 단계에 추가 정제없이 사용한다. Rf(TLC) 0.5(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-4-O-아세틸-1-티오-2,3,5-트리데옥시-β-L-아라비노-헥사피라노시드(45a)]

-78℃로 냉각된 디클로로메탄(100 mL)내 44(2.3 g, 12.23 mmol) 및 티오페놀(1.5 mL, 14.67 mmol)의 용액에 BF3ㆍOEt2(4.5 mL, 36.69 mmol)를 적가한다. 반응물을 저온에서 30분간 교반하고, 점차 -60℃로 가열한 다음 NaHCO3의 포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 CH2Cl2(3 x 25 mL)로서 추출하고; 유기층을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시켜 진공하에 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 고체로서 술파이드 45a(3.0 g, 92%)를 제공한다. Rf(TLC)=0.4(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-4-O-히드록시-1-티오-2,3,5-트리데옥시-β-L-아라비노-헥사피라노시드(45b)]

메탄올(100 mL)내 45a(3.0 g, 11.27 mmol)의 용액에 나트륨 메톡시드(365 mg, 6.76 mmol)를 첨가한다. 반응 혼합물을 상온에서 2시간 교반한 다음 암버라이트 수지(2.0 g)를 첨가하여 중화시키고 15분간 교반한다. 반응 혼합물을 여과하고 진공하에 농축하여 알코올 45b(2.52 g, 100%)를 제공한다. 이것을 다음 단계에 추가 정제 없이 사용한다. Rf(TLC)=0.2(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[케토 술파이드(46)로 산화]

디클로로메탄(150 mL)내 옥살릴 클로라이드(5.5 mL, 11.16 mmol)의 용액을 -78℃에서 DMSO(1.5 mL, 22 mmol)로서 처리한다. 10분후에 디클로로메탄(15 mL) 및 트리에틸아민(7 mL, 50.75 mmol)내 알코올 45b(2.27 g, 10.15 mmol)의 용액을 반응 혼합물에 첨가한다. 반응 혼합물을 저온에서 30분간 교반한 다음, 0℃로 가열하고 그것을 NaHCO3의 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 CH2Cl2(3 x 30 mL)로서 추출하고; 유기층을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시킨 다음 진공하에 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 황백색 오일로서 케톤 46(2.20 g, 97%)을 제공하였다. Rf(TLC) 0.35(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[술폭시드(21)로 케토 술파이드의 산화]

디클로로메탄(40 mL)내 술파이드 46(418 mg, 1.88 mmol)의 용액에 과량의 고체 나트륨 바이카보네이트(1.0 g)을 첨가하고 얻어진 혼합물을 -78℃로 냉각한다. 이 용액에 mCPBA(455 mg, 2.63 mmol)를 첨가하고 반응 혼합물을 저온에서 30분간 교반한다. 반응 혼합물의 온도를 0℃로 천천히 상승시킨 다음 NaHCO3포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 CH2Cl2(3 x 30 mL)로서 추출하고; 유기층을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고 진공하에 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 황백색 오일로서 술폭시드 47(380 mg, 85%)을 제공한다. Rf(TLC)=0.25(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[3-O-벤질-2,6-디데옥시-4-O-(트리메틸실릴)-α-L-갈락토피라노실-(1→4)-페닐-3-O-벤질-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈라토피라노시드]

술폭시드 22(350 mg, 0.78 mmol) 및 친핵제 23(129 mg, 0.39 mmol)을 예비혼합하고 증류된 톨루엔과 다같이 3회 공비증류한다. 새로 증류된 디에틸 에테르(9 mL)를 아르곤하에 불꽃 건조된 플라스크에 첨가하고 -78℃로 냉각한다. 예비혼합된 반응체를 증류된 디클로로메탄 6 mL에 용해시키고 플라스크에 첨가한다. 여기에 Hunig 염기(136 μL, 0.78 mmol)의 첨가가 이어진다. 5분간 교반후에 무수 트리플릭산(65.6 μL, 0.19 mmol)을 반응물에 첨가한다. 반응에 이어서 TLC(10% 에틸 아세테이트-석유 에테르)를 한다. 반응물을 -70℃로 가열하고 NaHCO3포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 용액을 CH2Cl2(3 x 15 mL)로서 추출하고; 유기층을 결합한 다음 무수 Na2SO4에서 건조시킨다. 용액을 진공하에 농축하고 플래쉬 크로마토그래피(5% 에틸 아세테이트-석유 에테르)에 의해 정제하여 오일(95 mg, 40% 수율)로서 생성물 디사카라이드를 제공한다. Rf(TLC)=0.8(10% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[3-O-벤질-2,6-디데옥시-α-L-갈락토피라노실-(1→4)-페닐-3-O-벤질-2,6-디데옥시-1-티오-α-L-갈라토피라노시드(48)]

전 단락에서 생성물 디사카라이드(70 mg, 0.11 mmol)를 새로 증류된 THF에 용해시킨다. 테트라부틸암모늄 플로오라이드(500 μL, 5 mmol)를 그 용액에 첨가한다. 반응을 1시간에 완료한다. NaHCO3용액에 반응 혼합물을 붓고 THF(3 x 15 mL)로서 추출하여 완성시킨다. 유기층을 결합하고 진공하에 농축시킨다. 생성물 48을 다음 단계에 추가 정제없이 사용한다. Rf(TLC) 0.4(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[ABC 트리사카라이드(49)]

술폭시드 21(60 mg, 0.22 mmol) 및 친핵제 48(61 mg, 0.11 mmol)를 예비혼합하고 증류된 톨루엔과 함께 3회 공비증류한다. 새로 증류된 디클로로메탄(1 mL)과 디에틸에테르(5 mL)를 불꽃 건조된 플라스크에 첨가하고 아르곤하에 -78℃로 냉각한다. 예비혼합된 친핵제 및 술폭시드를 디클로로메탄(3 mL)에 용해시키고 냉각된 플라스크에 첨가한다. 이것에 이어서 Hunig 염기(40 μL, 0.22 mmol)를 첨가한다. 5분후에 무수 트리플릭산(18.5 μL, 0.11 mmol)을 플라스크에 첨가한다. 반응물을 -78℃ 내지 -70℃ 사이에서 2시간 동안 교반한다. 그후 반응물을 NaHCO3포화 용액에 부어 냉각한다. 반응 혼합물을 CH2Cl2(3 x 15 mL)로서 추출하고, 유기층을 결합하고 무수 Na2SO4에서 건조시킨다. 용액을 진공하에 농축하고 플래쉬 크로마토그래피(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르)에 의해 정제하여 트리사카라이드 49(18 mg, 25% 수율)를 제공한다.

[시클라마이신 () 트리사카라이드의 일단계 형성]

술폭시드 21(417 mg, 1.812 mmol, 3.0 eq), 22(541 mg, 1.2 mmol, 2.0 eq) 및 친핵제 23(165 mg, 0.604 mmol, 1.0 eq)를 예비혼합하고 증류된 톨루엔과 함께 3회 공비증류시켜 완전히 건조시킨다. 출발 물질을 새로 증류된 CH2Cl2(20 mL)에 용해시키고 아르곤하에 50 mL 불꽃 건조된 플라스크에 첨가한다. 이 반응 혼합물에 새로 증류된 Et2O 20 mL를 첨가하고 이어서 메틸 프로피올레이트(9.06 mmol, 15 eq)를 첨가한다. 플라스크를 아세톤/건조 얼음조를 이용하여 -78℃로 냉각한다. 5분 후에, 트리플릭산(5.3 μL, 0.06 mmol, 0.05 eq)을 반응 혼합물에 적가한다. 반응에 이어서 TLC(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르)를 한다. 반응 혼합물을 천천히 반시간에 걸쳐 -70℃로 가열한 다음 그것을 NaHCO3포화 용액(30 mL)에 부어 냉각한다. 얻어진 이상 혼합물을 CH2Cl2(3 x 15 mL)로서 추출한다. 결합된 유기 추출물을 무수 Na2SO4에서 건조시키고 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 무색 오일로서 트라사카라이드 49(99 mg, 25%)를 제공한다. Rf(TLC) 0.2(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[시클라마이신 트리사카라이드(49a)]

술폭시드 21(190 mg, 0.8 mmol, 3.5 eq), 22a(230 mg, 0.48 mmol, 2.0 eq) 및 친핵제 23a(85 mg, 0.24 mmol, 1.0 eq)를 예비혼합하고 증류된 톨루엔과 함께 3회 공비증류하여 완전히 건조시킨다. 그후 출발 물질을 새로 증류된 CH2Cl2(5 mL)에 용해시키고 아르곤하에 25 mL 불꽃 건조된 플라스크에 첨가한다. 이 반응 혼합물에 새로 증류된 Et2O 5 mL 이어서 메틸 프로피올레이트(4.8 mmol, 20 eq)를 첨가한다. 아세톤/건조 얼음조를 사용하여 플라스크를 -78℃로 냉각한다. 5분후에, 트리플릭산(5.3 μL, 0.06 mmol, 0.05 eq)을 반응 혼합물에 적가한다. 반응에 이어서 TLC(20% 에틸 아세테이트-석유 에테르)를 한다. 반응 혼합물을 반시간에 걸쳐 -70℃로 천천히 가열한 다음 그것을 NaHCO3포화 용액(30 mL)에 부어 냉각한다. 얻어진 이상 혼합물을 CH2Cl2(3 x 15 mL)로서 추출한다. 결합된 유기 추출물을 무수 Na2SO4에서 건조시키고 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 무색 오일로서 트라사카라이드 49a(35 mg, 20%)를 제공한다. Rf(TLC) 0.3(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[술폭시드로 술파이드의 산화]

트리사카라이드 술폭시드 49a(20 mg, 0.027 mmol)를 25 mL 플라스크에서 취한 새로 증류된 CH2Cl215 mL에 용해시킨다. 이 용액에 고체 NaHCO3(500 mg) 이어서 mCPBA(7.8 mg, 0.045 mmol)를 첨가한다. 반응에 이어서 TLC(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르)를 한다. 반응 혼합물을 천천히 -60℃로 가열하고 NaHCO3포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 이상 혼합물을 CH2Cl2(3 x 10 mL)로서 추출하고; 유기층을 결합하고 무수 Na2SO4에서 건조시킨다. 트리사카라이드 술폭시드 50a(PMB-보호 트리사카라이드 술폭시드)를 오일(19 mg)로서 얻는다. 그것을 글리코실화를 위해 정제 없이 사용한다.

[아글리콘 ε-피로마이시논을 얻는 마르셀로마이신의 분해]

마르셀로마이신, 53, 보헤믹산 착물(bohemic acid complex)로부터 분리된 안트라시클린 항생제는 시클라마이신과 동일한 아글리콘 ε-피로마이시논을 가지고 있다(참조, 아래). (마르셀로마이신은 브리스톨-마이어즈 스퀴브사의 관대한 증여품이다.) 산가수분해에 의해 마르셀로마이신 트리사카라이드를 제거함으로서 아글리콘을 얻을 수 있다.

약물(75 mg)을 메탄올성 HCl(25 mL, 0.1 N)에서 2시간 환류시킨다. 종료시에 마르셀로마이신(75 mg, 0.175 mmol)을 메탄올 HCl(25 mL, 0.1 N)에 용해시키고 50℃에서 2시간 환류시킨다. 이 시기의 종료시에 반응 혼합물은 진공하에 농축하고 예비 박층 크로마토그래피(15% 메탄올-클로로포름)에 의해 정제한다. 아글리콘 ε-피로마이시논을 밝은 적색 고체(21 mg, 54% 수율)로서 분리한다.

[아글리콘에 트리사카라이드의 커플링]

PMB-보호 트리사카라이드 술폭시드 50a(19 mg, 25 μmol), ε-피로마이시논(6 mg, 14.15 μmol) 및 스틸빈(stilbene)(2.5 mg, 14 μmol)을 예비혼합하고 증류된 톨루엔과 함께 3회 공비증류한다. 새로 증류된 에테르(2 mL)를 15 mL 불꽃 건조 플라스크에 첨가하고 아르곤하에 -78℃로 냉각한다. 공비증류된 반응체를 증류된 디클로로메탄(3 mL)에 용해시키고 플라스크에 첨가한다. 120분후에, 무수 트리플릭산(0.118 μL, 0.7 μmol)을 플라스크에 첨가하고 반응에 이어서 TLC(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르)를 한다. 반응 혼합물을 점차 -50℃로 가열하고 NaHCO3포화 용액으로 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 디클로로메탄(3 x 5 mL)으로서 추출하고; 유기층을 결합하고 무수 Na2SO4에서 건조시킨다. 용액을 진공하에 농축하고 플래쉬 크로마토그래피(15% 에테르-메틸렌 클로라이드 이어서 10% 메탄올-메틸렌 클로라이드)에 의해 정제한다. 생성물을 밝은 적색 고체(0.75 mg, 16% 수율)로서 분리한다.

[서로 다른 길이의 호모폴리머의 일-포트 합성]

제2도에서는 서로 다른 길이의 “호모폴리머”의 합성을 수행하는 본 발명의 다른 일예를 예시한다. 따라서, 서로 다른 비율의 이작용성 술폭시드 4-메톡시 페닐-3-O-벤질-4-O-트리메틸실릴-2-데옥시-1-술핀일-α-L-푸코피라노시드, B를 일작용성 글리코실 수용체 메틸-3-O-벤질-2-데옥시-α-L-푸코피라노시드, A, 및 염기 2,6-디-t-부틸-4-메틸피리딘(술폭시드에 비해 2 당량)과 분리 플라스크에서 혼합함으로서 서로 다른 길이 분포를 가진 2-데옥시 푸코스의 알파-연결된 호모폴리머를 제조한다. 다음 표는 실험 6.6.1-6.6.5의 각각에 사용되는 반응체 비율을 나타낸다. 혼합물을 처음에 톨루엔으로부터 공비증류에 의해(바람직하게는, 상기와 같이, 3회) 완전히 건조시킨다.

그후 혼합물을 각각 2.5-5 mL의 무수 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 아르곤하에 분리 25 mL 불꽃 건조 플라스크에 첨가한다. 각 반응 혼합물에 동일 부피의 새로 증류된 디에틸 에테르를 첨가한다. 다음에 아세톤/건조 얼음조를 사용하여 플라스크를 -78℃로 냉각한다. 5분후에, 무수 트리플릭산의 메틸렌 클로라이드 용액(B에 비해 1.0 당량)을 반응 혼합물에 적가한다. 용출제로서 15% 에틸 아세테이트/석유 에테르를 사용하여 박층 크로마토그래피에 의해 반응을 검측한다.

약 반시간에 걸쳐 -70℃로 가열한후, 반응 혼합물을 NaHCO3포화 용액(각각 약 30 mL)으로서 냉각한다. 얻어진 이상 혼합물 각각을 메틸렌 클로라이드(3 x 15 mL)로서 추출한다. 유기 추출물을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(1:5 에틸 아세테이드/석유 에테르)를 각 반응에서 글리코실화 생성물을 분리하는데 사용힌다. 제조된 “호모폴리머”의 길이 분포가 다음 표 3에서 제시된 바와 같이, B에 대한 A의 비율 및 또한 반응 혼합물에서 반응체의 전체 농도에 따라 변한다고 발견된다.

[표 3]

반응체의 몰비 및 총농도의 작용으로서 생성된 여러가지 “호모폴리머”의 상대량

AB = A-B (1H NMR, 아래 제공)

AB2= A-B-B (1H NMR, 아래 제공)

AB3= A-B-B-B (1H NMR, 아래 제공)

AB4= A-B-B-B-B (1H NMR, 아래 제공)

AB5= A-B-B-B-B-B (1H NMR, 아래 제공)

보다 구체적으로, 상기에 기재된 반응 결과는 술폭시드(320 mg, 0.714 mmol, 3.0 eq), 친핵제(60 mg, 0.238 mmol, 1.0 eq) 및 염기(147 mg, 0.714 mmol, 3 eq)를 예비혼합함으로서 얻어질 수 있다. 얻어진 혼합물을 톨루엔에서 3회 공비증류에 의해 건조시킨다. 그후 반응체를 증류된 CH2Cl22.5 mL에 용해시키고 아르곤하에 25 mL 불꽃 건조된 플라스크에 첨가한다. 그후 플라스크를 -78℃로 냉각하고 Et2O 2.5 mL를 반응물에 첨가한다. (술폭시드의 농도는 약 0.144 mmol/ml이다.) 10분후에 Tf2O(1.5 eq, 0.357 mmol, 60μl)를 첨가한다. 반응을 -78℃에서 1/2시간 유지시킨 다음, -70℃로 가열하고 이 온도에서 추가 1/2시간 교반한다.

반응 혼합물을 NaHCO3포화 용액에 부어 반응물을 냉각하고, 이어서 CH2Cl2로서 3회 추출하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피; 15% EA/PE; 20% EA/PE에 의해 정제를 완료한다. 여러가지 올리고사카라이드의 구조는 비말단 B가 X, X1, 또는 X2, 등으로 표시되어 있는, 프로톤 NMR 데이타(270 MHz, CDCl3)에 의해 뒷받침된다.:

[제어된 중합 반응]

본 발명의 다른 방법에 따라, 제어된 중합 반응을 다음과 같이 수행한다:

술폭시드 22(260 mg, 0.58 mmol), 친핵제 53(73 mg, 0.29 mmol) 및 염기 2,6-디-삼차부틸-4-메틸 피리딘(118 mg, 0.58 mmol)을 예비혼합하고 증류된 톨루엔으로 3회 공비증류한다. 25 mL 불꽃 건조 플라스크에 새로 증류된 디에틸 에테르(5 mL)를 첨가하고 아르곤하에 -78℃로 냉각한다. 공비증류된 반응체를 증류된 디클로로메탄(5 mL)에 용해시키고 플라스크에 첨가한다. 10분후에, 무수 트리플릭산(48.5 μL, 0.29 mmol)을 플라스크에 처마한다. 반응물을 -70℃에서 45분간 교반한 다음 NaHCO3의 포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 이상 혼합물을 CH2Cl2(3 x 15 mL)로서 추출하고; 유기층을 결합하고 무수 Na2SO4에서 건조시킨다. 용액을 진공하에 농축하고 플래쉬 크로마토그래피(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르)에 의해 정제한다. AB 디사카라이드 54(70 mg, 45%) 및 ABB 트리사카라이드 55(40 mg, 20%)를 오일로서 분리한다. AB 디사카라이드: Rf(TLC)=0.4(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[강력한 DNA 결합 활성이 있는 글리코콘주게이트의 일-포트 합성]

용액에서 복수 글리코시드 결합을 형성하는 전략이 강력한 DNA 결합 활성이 있는 몇가지 글리코콘주게이트를 동일 반응에서 합성하는데 사용할 수 있다. 상황에 따라, 글리코콘주게이트를 분리하고 DNA 결합 활성에 대해 각각 스크리닝하거나 그들을 혼합물로서 스크리닝할 수 있다. 예를들어, 각각 강력한 DNA 인터컬레이터(intercalator) 및 올리고사카라이드 측쇄로 구성되고, 올리고사카라이드 측쇄의 길이에서만 서로 다른, 글리코콘주게이트의 혼합물을 글리코실 수용체에 대해 이작용성 도너의 4:1 비율을 사용한 것외에, 실시예 6.6과 같이 합성한다. 특히, 2-데옥시 푸코실 술폭시드 유도체 B(908 mg, 1.90 mmol), 글리코실 수용체 A(294 mg, 0.48 mmol), 및 2,6-디-삼차부틸-4-메틸 피리딘(779 mg, 3.80 mmol)을 결합하고, 톨루엔에서 3회 공비증류에 의해 건조시킨 다음 에테르/메틸렌 클로라이드(새로 증류된 용매)의 1:1 혼합물 10mL에 용해시킨다. 용액을 아르곤하에 불꽃 건조된 플라스크로 이동시킨다. 아세톤/건조 얼음조를 사용하여 플라스크를 -78℃로 냉각한다. 5분후에, 무수 트리플릭산 161.1 μL(0.96 mmol)를 반응 혼합물에 적가한다. 반응물을 반시간에 걸쳐 -70℃로 천천히 가열한 다음 NaHCO3(30 mL)의 포화 용액으로 부어 냉각한다. 혼합물을 메틸렌 클로라이드(3 x 15 mL)로서 추출한다. 결합된 유기 추출물을 무수 Na2SO4에서 건조시키고, 여과한 다음, 용매를 진공하에 제거한다. 반응물을 습윤한 메틸렌 클로라이드 10 mL에 용해시키고 상온에서 과량의 디클로로디시아노퀴논(DDQ)으로 1시간 처리하여 p-메톡시 벤질 에테르 보호기를 제거한다. 그후 용매를 진공하에 제거하고 성분을 실리카 겔에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 분리한다.

DNA에 대한 그들의 상대 친화도를 올리고사카라이드 측쇄의 바람직한 길이를 측정하여 평가한다. 친화도 크로마토그래피는 특정 수용체에 결합하는 올리고사카라이드를 확인하는데 사용될 수 있다. 예를들어, 화합물의 혼합물을 관심 수용체(또는 이동상이 강력한 수용체의 혼합물을 함유한다면, 리간드)가 결합되어 있는 고체 지지체를 함유한 컬럼위에서 통과시킨다. 수용체에 결합되는 화합물은 그렇지 않는 화합물 보다 길게 컬럼에 체류된다. 화합물을 수용체에 대한 그들의 친화도에 따라 분별할 수 있다.

따라서, 탄수화물을 결합하는 수용체가 고체 지지체에 결합될 수 있다. 탄수화물 수용체는 DNA(이중 또는 단일 스트랜드됨), RNA, 프로테인, 올리고사카라이드, 또는 다른 분자로 구성될 수 있다. 핵산, 프로테인, 및 올리고사카라이드를 친화도 크로마토그래피에서 사용하는 고체 지지체에 결합하는 방법이 기술된 바 있다(참조: (a) Template Chromatography of Nucleic Acids and Proteins, Schott, H. Marcel Dekker, Inc. : New York, 1984; (b) Glycoconjugates: Composition, Structure and Function. Allen, H.J.; Kisailus, E.C., Eds. Marcel Dekker: NY 1992(및 그 관련 문헌). (주: 체류시간은 또한 친화도 컬럼으로 내려간 단일 화합물에 대한 친화도를 정량화하는데 사용될 수 있다.)

다른 실시예에서, 글리코실 수용체 A(제3도)를 2,3-p-메톡시 벤질-4-트리메틸실릴 람노실 술폭시드 C(제3도)와 예비혼합하고 상기에 기재된 것과 동일한 조건(예, 온도, 용매, 농도, 도너/수용체 비)하에 반응시킨다. 상기와 같이, 완성 및 DDQ로서 p-메톡시 벤질 보호기의 제거후에, 글리코콘주게이트의 혼합물을 실리카 겔 위 플래쉬 크로마토그래피에 의해 분리하고 DNA에 대한 서로 다른 화합물의 상대 친화도를 측정한다. 상기에 기재된 방법에 의해 제조된 글리코콘주게이트를 DNA에 결합하는 그들의 능력에 관해 비교한다. 이러한 방식으로, DNA 결합 친화도에 대한 서로 다른 슈가의 효과를 비교하여 바람직한 슈가를 확인할 수 있다.

제3도에서 글리코실 수용체 A는 저온에서 Tf2O-Hunig 염기 CH2Cl2/에테르(1:1)를 사용하여 화합물 B(제3도)로서 적절히 보호된 주글론(juglone) 유도체(Inhoffen et al. Croatica Chem. Acta. 1957, 29, 329; Trost et al. J. Am. Chem. Soc. 1977, 99, 8116; 및 Stork and Hagedorn J. Am. Chem. Soc. 1978, 100, 3609의 방법에 의해 제조)를 글리코실화하여 제조된다. 표준 작업완성(본 발명의 다른 실시예에서 기재된 바와 같이, 추출을 포함) 및 용매의 제거후에, 생성물 혼합물을 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 0℃에서 과량의 테트라부틸암모늄 플루오라이드로서 처리한다. 용매를 진공에서 제거하고 생성물을 플래쉬 크로마토그래피에 의해 분리한다.

상기에 기재된 일반적 방법은 또한 여러가지 서로 다른 슈가를 함유한 글리코콘주게이트의 혼합물의 합성에 응용될 수 있다. 이 경우에, 두가지 또는 그 이상의 이작용성 글리코실 도너가 반응에 사용된다. 탈보호후에, 얻어진 글리코콘주게이트의 혼합물을 DNA 친화도 컬럼으로 내려 보냄으로서 DNA 결합 활성에 대해 스크리닝할 수 있다. 친화도 컬럼에서 그들의 체류 시간에 따라 화합물을 분별할 수 있다. 긴 체류 시간을 가진 화합물을 분리하고 구조 해명을 위한 표준 방법을 이용하여 확인할 수 있다.

[촉매 글리코실화 방법을 예시하는 추가 일예]

다음 실시예는 실릴화 글리코실 수용체를 포함한 반응을 비롯하여 촉매량의 술폰산에 의해 매개된 글리코실화 방법에 관한 것이다.

[1,2,3,4-테트라-O-아세틸-6-O-(트리메틸실릴)-D-글루코피라노스(2b)]

다음 방법은 친핵제의 모든 실릴화에 대한 전형이다. 알코올 2a(600 mg, 1.85 mmol, 1.0 eq) 및 트리에틸 아민(775 μL, 3.43 mmol, 3.0 eq)을 증류된 메틸렌 클로라이드에 용해시키고 아르곤하에 -78℃로 냉각한다. 트리메틸 실릴 트리플레이트(394 μL, 2.03 mmol, 1.1 eq)를 반응 혼합물에 첨가한다. 반응에 TLC 가 이어진다. 30 분후에 반응물을 NaHCO3포화 용액에 부어 냉각한다. 얻어진 이상 혼합물을 CH2Cl2(3 x 25 mL)로서 추출한다. 유기층을 결합하고 무수 Na2SO4에서 건조시킨다. 플래쉬 크로마토그래피에 의한 정제는 백색 고체로서 실릴 에테르 2b(700 mg, 90%)를 제공한다. Rf(TLC)=0.6(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[퍼벤질화 글루코스의 α,α-1,1-다이머(5)]

퍼벤질화 글루코스 1,1-다이머를 다음과 같이, 확인한다: Rf(TLC)=0.8(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[3,4,6-트리-O-벤질-2-데옥시-D-글루코피라노실-(1→6)-1,2,3,4-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노스(7)의 합성]

다음 방법은 TfOH를 사용하여 산 촉매 조건하에 모든 글리코실화 반응 런의 전형이다: 술폭시드 6(140 mg, 0.258 mmol, 1.5 eq) 및 친핵제 2(69 mg, 0.172 mmol, 1.0 eq)를 예비혼합하고 증류된 톨루엔으로서 3회 “공비증류”에 의해 완전히 건조시킨다. 그후 출발 물질을 새로 증류된 CH2Cl28 mL에 용해시키고 아르곤하에 25 mL 불꽃 건조 플라스크에 첨가한다. 플라스크를 아세톤-건조 얼음조를 이용하여 -78℃로 냉각한다. 메틸 프로피올레이트(200 μL, 2.58 mmol, 15 eq)를 술펜산 스캐빈저로서 이 용액에 첨가한다. 용액을 -78℃에서 2분간 교반한 후, 트리플릭산(1.1 μL, 0.0129 mmol, 0.05 eq)을 첨가한다. 반응에 TLC(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르)가 이어진다. 반응 혼합물을 1시간에 걸쳐 -30℃로 천천히 가열하고, 그후 그것을 NaHCO3포화 용액(25 mL)에 부어 냉각한다. 얻어진 혼합물을 CH2Cl2(3 x 15 mL)로서 추출한다. 유기 추출물을 결합하고, 무수 Na2SO4에서 건조시키고, 농축한다. 플래쉬 크로마토그래피(255 에틸 아세테이트-석유 에테르)는 백색 고체로서 디사카라이드 7(116 mg, 88%)을 제공한다. Rf(TLC)=0.3(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[메틸-6-데옥시-3,4-이소프로필리덴-2-O-(트리메틸실릴)-β-D-갈락토피라노시드(8)]

다음 세단계 시퀀스에 의해 D-푸코스로부터 화합물 8을 합성한다 : (i) MeOH. H+; (ii) 아세톤, H3PO4(cat); (iii) TMSOTf, Et3N, CH2Cl2, -78℃, Rf(TLC)=0.5(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[3,4,6-트리-O-벤질-2-데옥시-D-글루코피라노실-α-(1→2)-메틸-6-데옥시-3,4-이소프로필리덴-β-D-갈락토피라노시드(9)]

Rf(TLC)=0.5(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-4-O-아세틸-2,3,6-트리데옥시-1-술핀일-α-L-에리트로-헥소피라노시드(10)]

화합물 10을 3 단계로 L-람날로부터 합성한다. a) H2(1 atm), Pd(OH)2/C, C6H6; b) BF3ㆍOEt2, 티오페놀, CH2Cl2, -78℃ 내지 -60℃; 및 c) mCPBA, CH2Cl2, -78℃ 내지 -60℃, Rf(TLC)=0.4(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[4-O-아세틸-2,3,6-트리데옥시-L-에리트로-헥소프리노실-α-(1→6)-1,2,3,4-테트라-O-아세틸-β-D-글루코피라노스(11)]

Rf(TLC)=0.3(25% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-3,4-비스-O-(4-메톡시-벤조일)-1-술핀일-D-디기톡소스(13)]

다음 세 단계 시퀀스에 의해 디기톡소스로부터 화합물 13을 합성한다 : (i) pOMeC6H4OCI, 피리딘; (ii) 티오페놀, Et2OㆍBF3, CH2Cl2; (iii) mCPBA. Rf(TLC)=0.2(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-3,4-O-(4-메톡시-벤조일)-β-D-디기톡소실-(O)-N-히드록시에틸 카르바메이트(14)]

Rf(TLC)=0.45(cc 아노머 , 40% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

Rf(TLC)=0.5(β아노머 , 40% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-2,3-O-벤조일-6-데옥시-1-티오-β-L-갈락토피라노시드(15)]

다음 네 단계 시퀀스에 의해 L-푸코스로부터 화합물 15를 합성한다 : (i) Ac2O, 피리딘; (ii) 티오페놀, Et2OㆍBF3; (iii) NaOMe, CH3OH, 암버라이트 H+수지; (iv) C6H5COcl, DMAP. Rf(TLC)=0.6(40% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[페닐-3,4-O-아세틸-2,6-디데옥시-1-술핀일-L-갈락토피라노시드(16)]

다음 두단계 시퀀스에 의해 1,3,4-트리-O-아세틸-2-데옥시-α-L-푸코스로부터 화합물 16을 제조한다 : (i) 티오페놀, Et2OㆍBF3; 및 (ii) mCPBA. Rf(술파이드에 대한 TLC)=0.3(15% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

Rf(술폭시드에 대해 TLC)=0.25(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[3,4-O-아세틸-2,6-디데옥시-L-갈락토피라노실-α-(1→4)-페닐-3,4-O-벤조일-6-데옥시-1-티오-β-L-갈락토피라노시드(17)]

Rf(TLC)=0.4(30% 에틸 아세테이트-석유 에테르).

[고상에서 β-연결된 디사카라이드의 합성]

2,3,4-트리벤질-6-트리틸갈락토스-1-p-히드록시 페닐티오글리코시드 세슘 아세테이트(X, 제6도) 0.338 g(0.350 mmol)을 함유한 DMF 10 mL 용액에 메리필드 수지(BACHEM Biosceince) 0.356 g(0.385 mmol Cl 당량, 1.1 당량)을 첨가한다. 이 혼합물을 아르곤 분위기하에 75℃에서 손목작용 쉐이커로서 교반한다. 이 때, 폴리머를 태어드 조질-프릿화 구치 깔때기(tared coarse-fritted Gooch funnel)에 붓고 메탄올과 메틸렌 클로라이드로 반복하여 세척한다. 그후 깔때기를 동결건조기 자(jar)에서 20 밀리토르에 4h 동안 건조시킨다. 0.244g의 중량 변화가 기록되고, 이것은 세슘염에 관해 85% 화학적 수율임이 계산된다.

조질-프릿화 구치 깔때기내 폴리머를 보통의 유속에서 진공 여과에 의해 황색이 여과액에서 명백하지 않을 때까지 메틸렌 클로라이드 내 10% 트리플루오로초산(TFA) 40 mL 로서 처리한다(TFA는 트리틸 보호기를 제거하는데 사용된다). 다음에 폴리머를 메탄올과 메틸렌 클로라이드로 반복하여 세척한다. 수지-연결 친핵제와 다같이 깔때기를 동결건조기 자에서 “모으기”(massing)전에 20 밀리토르에서 4h 동안 건조시킨다. 이어서 0.065g의 중량 변화를 측정하고, 이것은 세슘염에 관해 83% 화학 수율임이 계산된다. 수지-연결 친핵제(수지-X, 제6도)의 농도가 0.544 mmol/g임이 계산된다.

유도체화 수지 200 mg(즉, 0.11 mmol)를 반응관에서 밤새 동결건조 시킨 다음 아르곤으로서 1시간 퍼지한다. 그후 수지를 CH2Cl25 mL에 분산시킨다. 2-피발로일-3,4-벤질-6-p-메톡시 벤질 갈락토실 페닐 술폭시드(Y, 제6도) 4 당량(0.44 mmol) 및 2,6-디-t-부틸-4-메틸 피리딘 6 당량(0.66 mmol)을 메틸렌 클로라이드 5 mL에 용해시키고 캐뉼라에 의해 반응관에 첨가한다. 혼합물을 아르곤 플로우에 의해 상온에서 30분간 부드럽게 교반한 다음 반응관을 냉각조에 담그고 -60℃로 냉각시킨다. 메틸렌 클로라이드에 백배(v/v) 희석된 무수 트리플릭산 2 당량(0.22 mmol)을 반응관에 천천히(15분에 걸쳐) 첨가한다. 얻어진 반응 혼합물을 1 시간 동안 부드럽게 교반한다.

반응이 완료된 후, Hg(Ⅱ) 기수분해법 및 TLC 분석에 의해 제시된 바와 같이, 용매 및 미결합 시약을 반응관에서 배출시키고, 수지 혼합물을 메탄올 이어서 메틸렌 클로라이드로서 반복하여 린스한다. 이어서, 수지 혼합물을 메틸렌 클로라이드 15 mL에 분산시킨 다음 과량의 Hg(OCOCF3)로서 8 시간 동안 처리하여 글리코시드 결합을 수지에 결합한다 (주: 수지로부터 충분한 생성물을 제거하여 TLC 분석에 의해 반응을 검측하는데 단지 5분이 필요하다). 용매를 수지로부터 유출시킨다. 수지를 린스하는데 추가 용매를 사용한다. 여과액을 결합하고, 물로서 3회 추출하고 증발에 의해 농축한다. 원하는 β-연결 디사카라이드를 실리카 겔에서 플래쉬 크로마토그래피에 의해 얻는다. 반응물에서 α-연결 디사카라이드가 분리되지 않는다.

제6도에서 티오슈가 X를 쉽게 이용가능한 1,6-안히드로글루코스로부터 벤질 브로마이드로서 처리 이어서 산가수분해(H2SO4-THF-H2O), 보다 반응성인 C6 일차 알코올의 트리틸화(트리틸 클로라이드-피리딘), 및 디술파이드 XX 및 트리-n-부틸포스핀으로서 얻어진 락톨의 처리에 의해 제조한다(즉, 락톨로부터 티오페닐 글리코시드를 제조하는 표준 과정). 쉽게 이용가능한 4-히드록시티오페놀의 디술파이드를 α-브로모-메틸 아세테이트와 반응시켜 제조한다.

제6도에서 술폭시드 Y를 다음 시퀀스의 시약을 이용하여 쉽게 이용가능한 펜타-아세틸화 갈락토스로부터 제조한다: (1) BF3/에테르에이트-티오페놀; (2) 히드록시드; (3) 아세톤-H+; (4) p-메톡시 벤질 브로마이드-나트륨 하이드라이드; (5) 피발로일 클로라이드; (6) mCPBA. 각 단계가 본 기술에 잘 알려져 있으며 표준 조건하에 반응을 수행한다(참조, 그 개시가 본 발명에서 참고에 속하는 단락 6.15 아래의 “표준 참고문헌”의 리스트).

X와 Y의 반응에서 생성된 디사카라이드를 가메탄올분해시키고(수지로부터 그것을 제거하기 위해)1H NMR 스펙트로스코프에 의해 특성화 한다. 관련 데이타는 다음을 포함한다: (CDCl3) 5.58 ppm(d, J=5.3 Hz, 티오슈가의 H1), 5.47 ppm(dd, J=7.9, 10.2 Hz, C2 피발로일화 슈가의 H2). 4.45 ppm(d, 부분적으로 겹침, C2 피발로일화 슈가의 H1).

[고상에서 α-연결 디사카라이드의 합성]

글리코실 수용체의 나트륨염(X, 제7도)을 표준 방법(DMF, 80℃, 24h)에 의해 메리필드 수지에 결합시킨다. 커플링과 린싱에 이어서(실시예 6.10에 기재된 바와 같이), 수지를 동결건조시키고 칙량한다. 질량 증가로부터 0.52 mmol/g에서 하중을 계산한다.

유도체화 수지 200 mg(즉, 0.1 mmol)를 반응관에서 밤새 동결건조시킨다음(제7도) 아르곤으로서 1시간 동안 퍼지한다. 수지를 메틸렌 클로라이드 5 mL에 분산시킨다. 퍼벤질화 푸코실 술폭시드 Y 4 당량(0.4 mmol) 및 2,6-디-t-부틸-4-메틸 피리딘 6 당량을 메틸렌 클로라이드 5 mL에 용해시키고 시린지에 의해 반응관에 첨가한다. 혼합물을 아르곤 플로우에 의해 상온에서 30분간 부드럽게 교반한 다음 반응관을 냉각조에 침전시키고 -60℃로 냉각한다. 메틸렌 클로라이드에서 백배 희석된 무수 트리플릭산 2 당량(0.22 mmol)을 시린지에 의해(15분에 걸쳐) 반응관에 천천히 첨가한다. 반응물을 1 시간 동안 부드럽게 교반한다. 용매와 미결합 시약을 반응관에서 유출시키고, 수지 혼합물을 메탄올 이어서 메틸렌 클로라이드로서 반복하여 린스한다. 이어서, 수지 혼합물을 메틸렌 클로라이드 15 mL에 분산시킨 다음 과량의 Hg(OCOCF3)2로서 8 시간 처리하여 글리코시드 결합을 수지에 결합한다 (수지로부터 충분한 생성물을 제거하여 TLC 분석에 의해 반응을 검측하는데 단지 5분이 필요하다). 용매를 이전과 같이 수지로부터 유출시킨다. 그후 수지를 추가 용매로서 린스하고 여과액을 결합하고, 물로서 3회 추출한 다음, 증발에 의해 농축한다. 실리카 겔에서 플래쉬 크로마토그래피는 원하는 α-연결 디사카라이드만을 제공한다.

제7도에서 티오슈가 X를 본 기술에서 표준인 조건하에 쉽게 이용가능한 상응하는 글루코사민으로부터 다음 시약으로서 처리하여 제조한다; (1) 무수 프탈산; (2) 무수 초산; (3) 테트라클로로틴-4-히드록시 티오페놀; (4) 히드록시드; (5) 벤즈알데히드-H+; (6) NaH(참조, 다음 단락 6.15).

제7도에서 술폭시드 Y를 퍼아세틸화 푸코스로부터 출발 물질을 연속적으로 BF3/에테르에이트-티오페놀, 이어서 히드록시드, 이어서 벤질 브로마이드, 및 그후 mCPBA로서 처리하여 제조한다. 이들 모든 단계는 표준이며 본 기술에서 잘 알려져 있다.

Hg(OCOCF3)2로서 처리에 따라(디사카라이드를 수지로부터 제거하기 위하여) X 및 Y의 반응으로부터 생성된 디사카라이드를1H NMR에 의해 특성화한다. 관련 데이타: (CDCl3) 5.6 ppm(겉보기 t, J=7.6 Hz, C2프탈이미도 슈가의 H1), 3.35 ppm(d, J=7.6 Hz, 락톨 OH, 즉 Hg(Ⅱ)로서 수지로부터 가수분해 제거후에 프탈이미도 슈가의, 4.9 ppm(d, J=2.8 Hz, 푸코스 유도체의 H1).

[루이스 X 트리사카라이드의 고상 합성]

글리코실 수용체의 나트륨염(X, 제8도)을 표준 방법(DMF, 80℃, 24h)을 이용하여 메리필드 수지에 결합시킨다. 실시예 6.10에서 상세히 기재된 일반적인 연결 방법을 사용한후, 무수 수지를 메틸렌 클로라이드 5 mL에 분산시킨다. 2,3,4,6-피발로일화 갈락토실 술폭시드 Y 4 eq 및 염기(상기와 같이) 6 eq를 메틸렌 클로라이드 5 mL에 용해시킨다. 시약 용액을 수지에 첨가하고, 반응 혼합물을 -60℃로 냉각한다. 메틸렌 클로라이드에서 백배(v/v) 희석된 무수 트리플릭산 2 당량을 첨가한다.

30분후에, 수지를 “유출”시키고(drained) 메틸렌 클로라이드와 메탄올로서 반복하여 린스한다. 그후 수지를 5 mL에 분산시키고 0℃로 냉각한다. 트리플루오로초산/메틸렌 클로라이드 1:2 용액 5 mL를 첨가하고, 수지를 5시간 동안 부드럽게 교반한다. 그후 수지를 “유출”시키고 메틸렌 클로라이드와 메탄올로서 반복하여 린스한다. 무수 메틸렌 클로라이드로서 최종 린스에 이어서, 수지를 무수 메틸렌 클로라이드 5 mL에 분산시킨다. 2,3,4-트리에틸실릴 푸코실 술폭시드 Z 4 당량 및 힌더드 염기(즉, 상기에 사용된 것) 6 당량을 메틸렌 클로라이드 5 mL에 용해시키고 수지에 첨가한다. 반응 혼합물을 -60℃로 냉각한다. 무수 트리플릭산 2 당량을 메틸렌 클로라이드에서 100 배 희석하고 시린지에 의해 반응물에 천천히 첨가한다. 30분간 부드럽게 교반한후, 수지를 “유출”시키고 린스한다. 그후 트리사카라이드를 제거하고 실시예 6.10에서 상기에 기재된 바와 같이, Hg(OCOCF3)2를 사용하여 수지로부터 분리한다.

제8도에서 티오슈가 X를 쉽게 이용가능한 글루코사민으로부터 (1) 무수 프탈산; (2) 무수 초산; (3) 테트라클로로틴-4-히드록시 티오페놀; (4) 벤질 브로마이드; (6) 벤즈알데히드-H+; (7) 클로로메틸 메틸 에테르(MOM 클로라이드); (8) H2O/H+; (9) 피발로일 클로라이드; (10) 수소화, Pd(OH)2; (11)NaH로서 처리에 의해 제조한다. 다시, 모든 단계는 4-히드록시 티오페닐 글리코시드상의 벤질 보호기의 탈보호를 위한 조건을 포함한 표준이며, 조건은 데벤질화에 대해 전형적이다. 데벤질화 단계에서, 황 결합으로 슈가의 분해가 관찰되지 않는다.

제8도에서 술폭시드 Y가 퍼피발로일화 갈락토스를 BF3/에테르에이트-티오페놀, 이어서 mCPBA로서 처리하여 제조한다.

제8도에서 술폭시드 Z를 퍼아세틸화 푸코스를 F3/에테르에이트-티오페놀, 이어서 연속적으로 히드록시드, 트리에틸실릴 클로라이드, 및 mCPBA로서 처리하여 제조한다.

유사하게, 루이스 A 및 루이스 B를 포함하나, 이에 국한되지 않는, 다른 루이스 혈액형(blood group) 슈가가 쉽게 합성된다.

[고상에서 수행된 추가 실험]

제16도에 관련하여, 특히, 세슘 플루오라이드(157.2 mg, 1.03 mmol, 1.1 eq) 및 메리필드 수지(1 mol. eq. 그람당 CD(1.0975 g, 1.10 mol, 1.1 eq)를 DMF(20 mL)내 새로 제조된 1(803.5 mg, 0.94 mmol, 1.0 eq)의 용액에 첨가한다. 얻어진 분산액을 아르곤 분위기하에 60℃에서 24 시간 동안 기계적으로 교반한다. 슈가-유도체화 수지를 진공 여과에 의해 분리하고 DMF(3 x 10 mL), 메탄올(3 x 10 mL) 및 CH2Cl2(5 x 10 mL)로서 세척한 다음 진공하에 밤새 건조시켜 수지 2(1.4738 g, 질량 증가, 또는 0.34 mmol/g에 기초하여 계산)를 제공한다. IR(KBr disc) 1734 cm-1(υ, C=0)

수지 2를 CH2Cl2(20 mL)내 10% 트리플루오로초산으로 세척하여 보호기를 제거한다. 이어서, 탈보호된 수지 3을 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 세척하고 진공하에 밤새 건조시킨다. IR(MBr disc) 1734 cm-1(υ, C=0), 3430 cm-1(br, υ, O-H).

수지 5를 얻기 위하여, 3(95.4 mg)을 CH2Cl2(7.0 mL)내 술폭시드 4(122.1 mg, 0.156 mmol, 1.0 eq) 및 2,6-디-삼차부틸-4-메틸-피리딘(98.2 mg, 0.468 mmol, 3.0 eq)의 용액에 첨가하고 분산액을 -78℃로 냉각한다. 10분후에, CH2Cl2(5.0 mL)내 무수 트리플릭산(13.1 μL, 0.078 mmol, 0.5 eq)을 20분에 걸쳐 적가한다. 첨가 완료 10분후에, 반응물을 20분에 걸쳐 -60℃로 가열한다. 포화 NaHCO3의 첨가에 의해 반응물을 냉각한다. 수지를 감압 여과에 의해 수집하고 메탄올(2 x 10 mL), 물(1 x 10 mL), 메탄올(1 x 10 mL), 및 그후 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 세척한다. 생성물 수지 5를 진공하에 밤새 건조시키고, 그후 글리코실화를 반복한다.

생성물 수지 6을 다음과 같이 얻는다: 수지 5(112.7 mg)를 CH2Cl2(20 mL)내 10% 트리플루오로초산으로 세척한다. 그후 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 세척하고 진공하에 밤새 건조시킨다.

그후 수지 7을 수지 6으로부터 다음과 같이 얻는다: 수지 6(110.7 mg)을 CH2Cl2(7.0 mL)내 술폭시드 4(123.5 mg, 0.158 mmol, 1.0 eq) 및 2,6-디-삼차부틸-4-메틸-피리딘(99.3 mg, 0.474 mmol, 3.0 eq)의 용액에 첨가하고 분산액을 -78℃로 냉각한다. 10분후에, CH2Cl2(5.0 mL)내 무수 트리플릭산(13.3 μL, 0.079 mmol, 0.5 eq)을 20분에 걸쳐 적가한다. 첨가 완료 10분후에, 반응물을 20분에 걸쳐 -60℃로 가열한다. 반응물을 포화 NaHCO3의 첨가에 의해 냉각한다. 수지를 여과에 의해 분리하고 메탄올(2 x 10 mL), 물(1 x 10 mL), 메탄올(1 x 10 mL), 및 그후 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 세척한다. 생성물 수지 7을 진공하에 밤새 건조시키고, 그후 글리코실화를 반복한다.

끝으로, 화합물 8을 수지 7로부터 다음과 같이 얻는다: 수지 7(113.6 mg)을 CH2Cl2(20mL)내 10% 트리플루오로초산으로 세척한다. 그후 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 그것을 세척하고 피리딘(10 mL)에 분산시킨다. 무수 초산(183.7 μL, 1.932 mmol, 1.0 eq) 및 4-디메틸아미노피리딘(4.7 mg, 0.039 mmol, 0.02 eq)을 아르곤하에 분산액에 첨가한다. 혼합물을 밤새 교반한 다음 메탄올(200 μL)의 첨가에 의해 냉각한다. 수지를 여과에 의해 분리하고 메탄올(2 x 10 mL)과 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 세척한다. 유리 화합물 8을 다음에 기재된 바와 같이, 예를들어 디사카라이드 13의 합성을 위해, 습윤한 메틸렌 클로라이드내 비스(트리플루오로아세테이트)수은(Ⅱ)으로서 처리하여 수지로부터 유리시킨다. (화합물 8)

[디사카라이드 13 및 16의 고상 합성]

제17도의 반응식에 따라, Pht-보호 N-아세틸글루코사민 잔기 9를 고체 지지체에 다음과 같이 결합시킨다: 메리필드 수지(1.4075g, 1% 가교결합, 클로로메틸화 스티렌/디비닐벤젠 코폴리머, 약 1 mmol Cl/g, Aldrich)를 DMF(5 x 10 mL)내 새로 제조된 9(1.42 g, 2.693 mmol) 용액에 첨가한다. 분산액을 아르곤하에 60℃에서 24시간 동안 기계적으로 교반한다. 슈가-유도체화 수지를 여과에 의해 분리하고, DMF(5 x 10 mL), 메탄올(3 x 10 mL) 및 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 세척하고, 진공하에 밤새 건조시켜 수지-결합된 10 1.7466 g을 제공한다. 하중의 수준이 0.414 mmol/g(질양 증가를 기초로)임이 계산된다. IR(KBr) 1670, 1716 cm-1(υ, C=0); 3470 cm-1( υ, C=0).

수지 10을 술폭시드 11, 푸코스 유니트에 커플링하여 다음과 같이 12(α-글리코시드 결합)를 제공한다: 화합물 10(218.4 mg)을 CH2Cl2(7 mL)내 술폭시드 11(204.1 mg, 0.3766 mmol, 1.0 eq) 및 2,6-디-삼차부틸피리딘(236.7 mg, 1.1297 mmol, 3.0 eq) 용액에 첨가한다. 분산액을 -60℃로 냉각하고, 10분후에, CH2Cl2(5 mL)내 무수 트리플릭산(31.7 μL, 0.1883 mmol, 0.5 eq) 용액을 20분에 걸쳐 적가한다. 첨가 완료 10분후에, 반응물을 천천히 -30℃로 가열하고, 30분후에, 포화 나트륨 바이카보네이트 수용액의 첨가에 의해 냉각한다. 수지를 여과에 의해 분리하고, 메탄올(2 x 10 mL), 물(1 x 10 mL), 메탄올(10 mL) 및 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 세척하고, 진공하에 밤새 건조시켜 12를 제공한다.

최종 생성물 13을 다음과 같이 얻는다: Hg(OCOCF3)2(120.5 mg, 0.2824 mmol) 및 물(몇 방울)을 CH2Cl2(20 mL)내 12(222.0 mg)의 분산액에 첨가한다. 5h후에 혼합물을 면(cotton)을 통해 여과시킨다. 여과액을 포화 나트륨 바이카보네이트로서 세척하고, Na2SO4에서 건조시키고, 여과하고, 진공 농축한다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(35% EtOAc-석유 에테르)에 의해 정제하여 무색 고체로서 13 33.9 mg(59% 수율)을 제공한다. 이 고체를 RP-HPLC(C-18 컬럼, 물내 60-98% MeCN 30분에 걸쳐)에 의해 추가 정제한다. RT15.7분.

유사하게, 수지 10을 갈락토스 유니트, 14에 커플링하여 다음과 같이 수지 15β-글리코시드 결합)을 제공할 수 있다: 화합물 10(184.0 mg, 0.414 meq./g)을 CH2Cl2(7 mL)내 술폭시드 4(208.0 mg, 0.325 mmol) 및 2,6-디-삼차부틸피리딘(204.3 mg, 0.975 mmol)의 용액에 첨가한다. 분산액을 -60℃로 냉각하고, 10분후에, CH2Cl2(5 mL)내 무수 트리플릭산(31.7 μL, 0.1883 mmol, 0.5 eq)의 용액을 20분에 걸쳐 적가한다. 첨가 완료 10분후에, 반응물을 천천히 -30℃로 가열하고, 30분후에, 포화 나트륨 바이카보네이트 수용액의 첨가에 의해 냉각한다. 수지를 여과에 의해 분리하고, 메탄올(2 x 10 mL), 물(1 x 10 mL), 메탄올(10 mL) 및 CH2Cl2(10 x 10 mL)로서 세척하고, 진공하에 밤새 건조시켜 15를 제공한다. 가장 좋은 결과를 얻기 위하여, 글리코실화 과정을 2회 반복한다.

Hg(Ⅱ)시약을 사용하여 수지로부터 생성물을 제거한다. Hg(OCOCF3)2(325.0 mg, 0.2824 mmol) 및 물(몇 방울)을 CH2Cl2(20 mL)내 15(222.0 mg)의 분산액에 첨가한다. 5h후에 혼합물을 면을 통해 여과시킨다. 여과액을 포화 나트륨 바이카보네이트로서 세척하고, Na2SO4에서 건조시키고, 여과한 다음 진공 농축한다. 잔사를 플래쉬 크로마토그래피(35% EtOAc-석유 에테르)에 의해 정제하여 16 19.4 mg(28% 수율)을 제공한다. 이 생성물을 RP-HPLC(C-18 컬럼, H2O에서 60%-95% MeCN 30분에 걸쳐)에 의해 추가로 정제할 수 있다. RT= 26.1분.

[표준 참고]

상기에 언급된 대부분의 변형(보호: 슈가의 벤질화, 벤질디덴화, 아세톤화, 에스테르화, 및 카르보- 또는 실릴에텐화; 탈보호:데벤질화, 벤질리덴 또는 아세톤의 산성 가수분해, 에스테르의 염기성 가수분해, 플루오라이드로서 또는 산성 조건하에 실릴기의 제거)이 Binkley, R. W. Modern Carbohydrate Chemistry, Marcel Dekker, Inc. : New York, 1988에 기재되어 있다. 락톨 또는 아노머 에스테르를 티오페닐기로 전환하는 방법(티오페닐 글리코시드를 제조하기 위하여)이 잘 알려져 있다(참조예, Ferrier et al. Carbohydr. Res. 1973, 27, 55; Mukaiyama et al. Chem. Lett. 1979, 487; Van Cleve Carbohydr. Res. 1979, 70, 161; Hanessian et al. Carbohydr. Res. 1980, 80, C17; Garegg et al. Carbohydr. Res. 1983, 116, 162; 및 Nicolaon et al. J. Am. Chem. Soc. 1983, 105, 2430).

본 발명에서 성취된 원리로부터, 본 기술에서 통상의 숙련가에게 글리코실화가 일어나는 순서를 조절하도록 글리코실 도너 및 글리코실 수용체 모두의 반응성을 조절하는 능력이 균일(용액에서) 또는 비균일(고상에서) 조건하에 신속하고, 효과적이며 높은 수율로 많은 다른 올리고사카라이드 또는 글리코콘주게이트를 합성하는데 이용될 수 있다는 사실이 명백하다.