▶▶ 분광광도법(Spectrophotometry) ▶ 원 리 일반적으로 빛(백색광)이 물체에 닿으면 그 빛은 ① 물체의 표면에서 반사 ② 물체의 표면에서 조금 내부로 들어간 후 반사 ③ 물체에 흡수 ④ 물체를 통과하는 빛으로 나누어지는데 물체에 의하여 흡수되는 빛의 양은 그 농도에 따라 다르다. 그러므로 이와 같은 빛의 흡수현상을 이용하면 시료용액 중의 빛을 흡수하는 화학물질의 양을 정량할 수 있다. 이와 같이 시료용액, 또는 적당한 시약을 넣어 발색시킨 용액의 흡광도법이라고 하는데 주로 자외선(ultraviolet, 180~320nm) 및 가시광선 (visible, 320~800) 영역에서 빛의 흡수를 이용한다. 그림 3-1에서 보는 바와 같이 빛이 시료를 통과하게 되면 시료에 의하여 빛이 흡수되기 때문에 빛의 강도는 약해진다. 시료용액을 통과한 빛의 양(transmittance, T)은 흡광물질이 존재하지 않았을 때의 빛의 강도(I0)에 대한 흡광물질이 존재할 때의 빛의 강도(I), 즉 T=I/I0로 표시되기 때문에 빛의 통과율은 항상 1보다 작으며 다음과 같이 %로 표시될 수 있다. %T= T×100 - log T=K×C 다음의 예를 통하여 빛의 통과율, 흡광도에 대한 이해도를 높이도록 하자. 예1) 빛의 통과율이 0.347이면 흡광도는 얼마인가?
예2) %T 가 49.6%인 시료의 흡광도는 ? %T = T×100 이므로 T= 49.6/100= 0.496 예3) 흡광도가 0.774이면 %T는? 위의 A = KC의 관계를 Beer's law라고 한다. 하지만 시료의 흡광도는 위에서 설명한 시료중의 흡광 물질의 농도에 의해서만 결정되지 않는 다. 즉 그림
3-2에서 보는 바와같이 cuvette의 직경 또는 폭에 따라서 흡광도는 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성에 따라서도 달라지는데 이것을 몰 흡수계수(molar avsorptivity)라고 하며 ε로 표시한다. 그러므로 Beer's law는 다음과 같이 쓸 수 있다.
이와 같은 편차는 일반적으로 농도 변화에 따른 화합물의 본질 변화에 기인한다고 할 수 있다. 예를 들면 용액에서 어떤 산, 염기, 염 등은 농도가 희석될수록 그들의 이온화가 증가되는데 이들 이온의 빛 흡수는 이온화되지 않은 분자들의 그것과 다르기 때문이다. 또한 어떤 유기 화합물은 농도의 변화에 따라서 응집되는 경향이 있다. 다라서 흡광도를 측정할 때에는 표준용액을 사용하여 standard curve를 얻은 후 Beer's law가 적용되는, 즉 농도와 흡광도가 정의 상관관계를 나타내는 범위의 농도에서 흡광도를 측정하는 것이 좋다. 흡광도를 측정할 때, 시료 용액은 cuvette이라고 불리우는 용기에 넣어져 빛의 통로에 놓여지는데 이 때에 가능한 같은 cuvette을 사용하여야 하며, 두 개 이상의 cuvette의 굴절율, 반사율, 내부두께 등의 서로 다르면 시료의 흡광도는 그 물질의 농도 뿐만 아니라 이들에 의해서도 달라지기 때문이다. 표준화된 cuvette이란 빛에 대한 굴절율, 반사율 그리고 내부두께 등이 동일한 cuvette을 말하는데 일반적인 기준은 빛의 50%를 통과시키는 용액에서 cuvette사이에 1%이상의 차이가 없어야 한다. 또한 cuvette은 회전에 의하여 굴절율, 반사율, 내부두께 등이 달라질 수 있기 때문에 흡광도를 측정하는 기구(분광광도계)내에서 cuvette은 정확한 위치에 있어야 한다. 예를 들면 그림 3-5에서 보는 바와 같이 cuvette의 세로선은 분광광도계 cuvette holder의 세로선에 일치하게끔 놓여져야 한다. Cuvette에는 여러 종류의 흠이 있거나 지문, 용매 등이 묻어 있을 수가 있는데 이들도 역시 흡광도에 영향을 미치기 때문에 잘 닦여져야 한다. 분자는 원자와는 달리 그림 3-6에서 보는 바와 같이 광범위한 범위에 걸쳐 여러 파장을 지니는 빛을 계속적으로 흡수한다. 하지만 분광광도 법에 의하여 시료용액 중의 어떤 흡광물질의 농도를 측정하려면 그 물질의 빛을 가장 많이 흡수할 수 있는 빛의 파장, 즉 흡광도가 최대인 파장을 선택하여야 한다. 왜냐하면 흡광도가 클수록 그 물질의 농도를 보다 정확히 측정할 수 있기 때문이다. 흡광도가 최대인 파장은 그림 3-6에서와 같이 각 파장(λ에 대한 흡광도를 측정하는 것에 의하여 쉽게 결정할 수 있다.
 그림 3-7. 분광광도계 ▶ 기 기(機器) 흡광광도법에서 빛의 흡광도를 측정하는 기구를
분광광도계(Spectrophotometer)라고 한다. 분광광도계는 그림 3-7과 같은 구조로 되어 있다. 분광광도계의 각 구성성분은 흡광분석의 효율을 크게 좌우하기 때문에 각 구성성분의 기능에 대하여 자세히 이해하는 것이 필요하다. 다음 분광광도계의 주요 부분에 대하여 설명하도록 한다. ① 광원(光源,light source) : 시료 중의 흡광물질 농도를 측정하는데 있어서 필요한 파장의 빛을 일정하게 낼 수 있어야 한다. 대부분의 분광광도계는 가시광선 범위의 스펙트럼 분석에는 텅스텐등을 사용하고 있으며 자외선 범위의 분석을 위해서는 수소등을 사용한다. ② 파장선택장치(wavelength selector) : 광원에서 나오는 빛은 넓은 파장 범위의 연석적인 복사선인데 위에서도 설명한 바와 같이 흡광광도법에서는 시료 중의 흡광물질이 빛을 최대로 흡수하는 파장에서 흡광도를 측정하여야 한다. 하지만 단일 파장의 빛을 얻으면 그 강도가 약해지는 반면에 순도가 크면 클수록 측정의 감도(sensitivity)는 더욱 커진다. 그림 3-8. 파장선택 장치 분광광도계는 파장 선택장치, 즉 프리즘이나 회절격자를 이용하는
단색화장치(monochromator)에 의하여 원하는 파장의 빛만을 시료에 공급한다. 그림 3-8에서 보는 바와 같이 파장선택장치는 회절발(diffraction grating)과 두 개의 slit으로 구성되어 있는데 slit은 회절발의 전, 후에 위치하고 있다. Slit은 불투명하며 광원에 대하여 직각으로, 좁게 열려 있는데 첫번째 slit은 광원으로부터 회절발로 들어가는 빛의 강도를 일정하게 조절하고 두번째 slit은 회절발이 무지개 색으로 분산시킨 여러 파장의 빛 중에서 어떤 특정 파장의 빛만이 시료 compartment에 들어가게 하는 중요한 역할을 한다. 시료 compartment로 들어가는 빛의 파장은 회절발의 회전에 의하여 시료가 조절될 수 있는데 분광광도계의 외부에는 이 회전을 조절하는 장치가 있다. ③ Cuvette holder와 sample compartment : Cuvette에 담겨진 시료용액의 흡광도가 측정되어 지는 곳으로 파장
선택장치로부터 나오는 일정한 파장의 빛에 의하여 시료가 조사되는 장소를 말하며 외부로부터 빛이 차단되어 있다. ④ 검출기(detector)와 지시기(readout device) : 시료용액을 통과한 빛에너지를 전기에너지로 변환하여 시료용액의 흡광도를 나타내는 장치이다. b. 분광광도계의 사용법 분광광도계를 사용하여 시료의 흡광도를 측정할 때에는 대조액(blank test)을 조제하여야 한다. 대조액은 흡광물질이 없는 용액을 말하는데 흡광물질을 제외하고는 시료용액과 반드시 동일하게 만들어져야 한다. 왜냐하면 시료 중에는 흡광물질 이외에 빛의 흡수에 영향을 미치는 다른 물질이 들어 있을 수도 있기 때문이다. 분광광도계는 반드시 빛의 통과율(%T)을 보정한 후에 사용하여야 한다. 즉 대조액에는 흡광물질이 들어 있지 않으므로 광원으로부터 나오는 빛을 100% 통과시킬 것이기 때문에 대조액의 통과율이 100%T를 나타내도록 보정하여야 하며 또한 광원으로 부터의 빛이 모두 흡수되어 검출기에 전혀 닿지 않는다면 통과율은 0%T가 될 것이기 때문에 이와 같은 조건에서 통과율이 0%T를 나타내도록 보정하여야 한다. 일반적으로 분광광도계의 외부에는 세 개의 조절자가 있는데 두 개는 분광광도계의 보정을 위한 조절자(0%T와 100%T)이며 나머지 한 개는 파장 조절을 위한 조절자이다. ▶ 발색시약과 가리움제 발색시약은 ① 발색된 색이 예민하고 안정할 것 ② 방해 성분이 적고 목적성분에만 반응할 것 ③ 발색된 화합물의 조성이 명확할 것 ④ Beer's law를 따를 것등의 조건을 지녀야 한다. 일반적으로 분석시료에는 흡광분석을 방해하는 물질들이 함유되어 있는 경우가 많다. 예를 들면 흡광분석법을 이용하여 시료 중의 단백질 양을 측정하는 Biuret법(104페이지 참조)은 vuffers, Tris와 몇몇 아미노산에 의한 방해를 받으며 Lowry(105페이지 참조)은 ammonium sulfate, glycine,
buffers, 그리고 mercaptans에 의하여 방해를 받는다. 이 때에는 제3의 물질로서 가리움체를 첨가하여 방해불질의 작용을 방지할 수 있는데 가리움제는 방해물질이 발색시약과 반응하지 못하게 하는 역할을 한다. |
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