부영양화된 우리의 수계에서 막여과법(membrane filtration, MF)을 이용해 총대장균군을 검출할 경우, 분변오염을 지시하는 총 대장균군 이외의 세균(background colonies)들이 총대장균군 검출 배지에서 과다성장(overgrowth)해 대장균 특유의 금속성광택이 없어지는 위음성(false-negative)현상과, 대장균군과 마찬가지로 유당(lactose)분해능을 가진 Aeromonashydrophila, Acinetobacter sp., Pseudomonas sp. 등의 세균들이 총대장균군 세균으로 간주되는 위양성(false-positive) 현상으로 수질을 오판하게 된다
(참고자료 : Alonso et al., 1996; Brenner et al., 1993).
선택배지상의 전형적인 총 대장균군 콜로니뿐 아니라 plate 상의 모든 콜로니를 순수 배양하여 동정해보기 전에는 실재하는 총대장균군수 파악이 불가능하므로 이를 대체할 수 있는 유의성이 있는 결과가 보장되는 신속한 검출방법의 확립이 요구된다. 막여과법이 갖는 총대장균 검출시의 문제점은 또 다른 공정시험법인 최적확수법(MPN; Most Probable Numbers)을 도입해도 해결되지 않는다.
왜냐하면 MPN법도 막여과법과 마찬가지로 대장균군의 유당 분해능에 근거해 그 존재유무를 정량하는 방법이기 때문이다.
아울러 MPN법은 복잡하고 그 결과를 통계적인 표에 근거해 산출하므로 불명확하며 결과를
얻는데도 4일 이상이 걸리므로 물의 안전성을 신속하게 점검해야하는 대장균검출 취지에 맞지 않다고 할 수 있다.
먹는물 수질공정시험법(환경부)
수질 오염 공정 시험 기준 [총 대장균군-평판집락법]
<<총대장균군 -평판 집락법>>
배출수 또는 방류 수에 존재하는 총대장균군을 측정하는 방법으로 페트리접시의 배지 표면에 평판집락법 배지를 굳힌 후 배양한 다음
진한 적색의 전형적인 집락을 계수하는 방법이다.
1. 적용범위
지표수 ,폐수 등에 적용 할 수 있다.
2.분석기기 및 기구
-배양기,페트리 접시,피펫,항온 수조,희석액
-시약 및 표준 용액
(1)평판 집락법 배지 (Desoxycholate agar)
정제수 1 L에 배지를 표 1의 조성대로 넣고 pH(7.3 ± 0.2)로 맞춘 다음, 완전히 끓여서 녹인 후, 45 ℃ ～ 50 ℃까지 식혀 사용한다.
(주의 사항 : 고압증기멸균은 하지 않는다 )
성 분 | 조 성 |
펩톤 (peptone) | 10.0 g |
락토스 (lactose, C12H22O11, 분자량 : 342.30) | 10.0 g |
데속시콜레이트 나트륨 (sodium desoxycholate) | 1.0 g |
염화나트륨 (sodium chloride, NaCl, 분자량 : 58.50) | 5.0 g |
인산일수소칼륨 (dipotassium phosphate, K2HPO4, 분자량 : 174.18) | 2.0 g |
구연산제이철암모늄 (ferric ammonium citrate, C6H8O7.Fe.NH3, 분자량 : 264.85) | 1.0 g |
구연산나트륨 (trisodium citrate, Na3C6H5O7,분자량 : 258.07) | 1.0 g |
뉴트럴레드 (Neutral red) | 0.03 g |
한천 (agar, (C12H18O9)n) | 15.0 g |
3.대조군 시험
이 시험기준을 처음으로 실시할 경우나 배지 ,시약 등이 바뀔때마다 양성대조 군과 음성 대조군 시험을 동시에 실시하여야 하며 ,양성대조군 시험 결과는 양성,음성 대조군 시험결과는 음성으로 나왔을 경우에만 유효한 결과 값으로 판정 한다.
양성 대조군은 E.coli 표군 균주를 사용하고 음성 대조균은 멸균 희석수를 사용 하도록 한다.
4.분석절차
페트리 접시에 평판집락법 배지를 약 15ml 넣은 후 항온 수조를 이용하여 45℃ 내외로 유지 시킨다.
(주의 사항 : 3시간 겨오가시키지 않는 것이 좋다 .)
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평판 집락수가 30~300개가 되도록 시료를 희석 후 ,1ml씩을 시료 당 2매의 페트리 접시에 넣는다 .
(주의 사항: 시료의 희석부터 배지를 페트리 접시에 넣을 때까지 조작시간을 20분 으르 초과 하지 말아야 한다.)
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굳기 전에 좌우로 10회전 이상 흔들어 시료와 배지를 완전히 섞은 후 실온에서 굳힌다.
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굳힌 페트리 접시의 배지 표면에 다시 45 ℃로 유지된 평판집락법 배지를 3ml~5ml 넣어 표면을 얇게 덮고 실온에서 정치하여 굳힌 후
(35 ± 0.5) ℃에서 18시간 ～ 20시간 배양한 다음 진한 적색의 전형적인 집락을 계수한다.
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정확성을 기하기 위하여 실험할 때마다 1개 이상의 음성대조군 시험을 상기 방법과 동일한 조건하에서 같이 실시하여야 하며, 이 때 음성대조군 평판에서는 전형적인 총대장균군의 집락이 없어야 한다.
4.결과보고
집락수가 30개~300개 범위에 드는 것을 산술 평균하여 '총 대장균군수 /ml'로 표기하며 반올림 하여 유효숫자 2자리로 표기한다.결과 값의 유효숫자가 2자리 미만이 될 경우에는 1자리로 표기 한다.다만 결과값이 소수점을 포함하는 경우에는 반올림하여 정수로 표기한다.
수질이 양호한 경우 검출되는 총대장균군수가 일반적으로 낮으므로 모든 집락을 다 계수하여 표기 한다.